25、抑制肿瘤血管生成的蛋白质和肽类药物

抑制肿瘤血管生成的蛋白质和肽类药物

1. 重组抗体

1.1 重组抗体的产生与特性

基因工程技术使得重组抗体的产生成为可能，其目的是改善抗体在体内的治疗特性。高亲和力的重组抗体能够有效靶向肿瘤组织，并迅速从正常组织和循环中清除，从而显著提高肿瘤选择性。最初，重组抗体是通过从相应的杂交瘤细胞系中克隆可变重链（VH）和轻链（VL）结构域，通过合成接头连接并表达为分子量为25 - 27 kDa的单链可变片段（scFv）。随后，分子生物学技术允许从VH和VL种系基因生成大量的抗体片段库，从而绕过了免疫和杂交瘤技术。scFv文库可以在丝状噬菌体表面表达，并筛选与所需抗原的结合。从噬菌体表达文库中回收的scFv通常显示出中等结合强度（Kd = 10−5 - 10−8 M）。由于其易于分离、获得完全人源序列的可能性以及识别几乎任何表位和高度保守抗原的能力，scFv分子在生物医学研究中迅速普及。然而，scFv分子的单价性质及其中等至低亲和力，常常导致与靶抗原的短暂相互作用。可以通过突变CDR的关键残基（以增加亲和力）或增加结合位点的数量（以增加亲和力）来改善scFv片段。已经设计出具有改善的组织靶向和药代动力学特性的二聚体scFv（即双抗体，55 kDa）。通过生成更大的重组片段，如可自组装成80 kDa二价二聚体的微型抗体，还获得了进一步的改进。

1.2 重组抗体的应用

重组抗体正在开发和测试用于诊断（即将成像造影剂靶向到肿瘤组织）和治疗目的（即将药物或放射性同位素靶向到肿瘤部位）。此外，通过传统生化方法或基因工程还产生了双特异性和双功能抗体。通过基因工程，还可以添加额外的蛋白质结构域（如毒素、酶），以创建具有全新功能的“设计抗体分子”。这些重组抗体在癌症和其他疾病的免疫诊断和免疫治疗中已被证明是有用的，其中一些已进入临床试验。

1.3 抗EDB + - 纤连蛋白抗体L19

以抗EDB + - 纤连蛋白为例，scFv抗体L19特异性针对纤连蛋白的ED - B结构域，这是一种在啮齿动物、灵长类动物和人类中高度保守的血管生成标志物。L19是通过筛选人scFv噬菌体展示文库与从二维凝胶斑点洗脱的抗原结合而产生的。原始抗体通过VH链中六个残基的组合突变进行了亲和力成熟，产生了具有非常高亲和力（Kd = 54 pM）的scFv。放射性标记的L19在小鼠实验性肿瘤中有效定位（注射3小时后，8.2%的注射剂量定位在肿瘤中）。由于抗体片段从循环中迅速清除，在稍后的时间点观察到高肿瘤与血液比率。离体微放射自显影分析显示，L19定位于肿瘤血管周围，但不在正常血管周围，这与免疫组织化学数据一致。随后，123I标记的二聚体L19在人类中测试了其靶向原发性肿瘤和转移灶的能力。二聚体L19抗体在肺癌和结直肠癌的肿瘤病变中选择性定位，且未检测到副作用。L19与生物活性分子（包括IL - 2、IL - 12、TNF或IFNγ）融合，并在小鼠中测试了其抗肿瘤活性。融合蛋白有效地靶向肿瘤血管，导致细胞因子在肿瘤内大量积累。因此，与游离细胞因子或与对照蛋白融合的细胞因子相比，细胞因子的治疗特性得到了显著增强。由于L19 scFv靶向的EDB结构域是肿瘤血管生成的标志物，在多种侵袭性实体瘤中大量表达，但在大多数正常组织中检测不到，这些观察结果可能为在人类癌症中使用L19 - 细胞因子缀合物进行治疗开辟了可能性。

1.4 其他靶向的血管生成相关分子

重组抗体靶向的其他与血管生成相关的分子包括VEGF - A、血管生成素 - 2、Flk - 1/KDR、层粘连蛋白和活化的玻连蛋白。

2. 可溶性VEGF - Rs（陷阱）

2.1 可溶性VEGF - R的作用机制

天然和重组的可溶性VEGF - R1和 - R2保留了与VEGF - A结合的能力，从而中和其生物活性。这表明可以使用可溶性VEGF - R1或 - R2作为VEGF拮抗剂。由于VEGF - R1对VEGF - A的亲和力比VEGF - R2高10倍，最初通过将VEGF - R1的前三个Ig结构域与Ig Fc区域融合创建了一种可溶性诱饵受体。这种融合蛋白保留了天然VEGF - R1对VEGF - A的结合亲和力（约10 pM），并抑制不同物种的VEGF - A，但需要高剂量给药才能达到最大抑制效果（高达25 mg/kg，而贝伐单抗的剂量为0.1 - 0.5 mg/kg），这主要是由于体内药代动力学特性较差。

2.2 VEGF Trap的特性与应用

为了在保持高亲和力的同时延长体内半衰期，产生了一种由VEGF - R1的第二个Ig结构域和VEGF - R2的第三个Ig结构域组成的Fc融合构建体。这种杂合分子具有增强的药代动力学特性，与VEGF - A的Kd = 1 - 10 pM，与PlGF - 2的Kd = 45 pM。VEGF Trap在临床前动物模型中显示出显著抑制血管生成和缩小肿瘤的功效，目前正在晚期实体癌患者的I期临床试验中进行测试。最近，一种VEGF - R3 - 免疫球蛋白（VEGF R3 - Ig）融合蛋白，它结合VEGF - C和 - D并抑制VEGF - R3信号传导，据报道可抑制肿瘤淋巴管生成并抑制向区域淋巴结的转移。

3. 小肽

3.1 血管靶向肽

3.1.1 肿瘤血管的分子差异

与正常静止的血管系统相比，肿瘤血管在其表面表达不同模式的分子。这些差异在分子水平上是由于生长因子受体、细胞粘附受体、蛋白酶或形态发生分子的表达变化所致。

3.1.2 肿瘤靶向序列的鉴定

体内筛选在其表面展示随机肽序列的噬菌体文库，导致鉴定出具有肿瘤血管归巢能力的短序列。通过这种策略鉴定出的肿瘤靶向序列包括cRGD - 4C（一种基于RGD的整合素靶向基序）、NGR（一种与氨肽酶N结合的基序）、CGKRK和CDTRL（两种与皮肤癌中未知受体结合的基序）、CRGRRST（一种与实验性肿瘤血管中血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）相关分子结合的基序）以及cCGNKRTRC（一种与肿瘤淋巴管结合的基序）。其中一些肽已被评估作为将造影剂、药物和其他治疗材料靶向到实体肿瘤的工具。这种基于肽的靶向策略目前正在临床上探索，以潜在地提高现有抗癌药物的疗效并减少其副作用。

3.1.3 NGR肽的研究

NGR三肽序列因其肿瘤靶向特性而得到了广泛研究。该基序最初是通过体内选择归巢到肿瘤血管的噬菌体展示文库而鉴定的。随后的研究表明，肿瘤血管中NGR肽的受体是氨肽酶N（也称为CD13），这是一种在多种细胞表面表达的蛋白酶，在小鼠和人类肿瘤的内皮细胞中上调。不同抗体的组织免疫染色表明，氨肽酶N的不同亚型在肿瘤相关血管、白细胞和上皮细胞中表达。直接结合测定和用抗氨肽酶N抗体进行的竞争性抑制实验表明，只有肿瘤血管中表达的氨肽酶N亚型作为NGR基序的受体。氨肽酶N拮抗剂特异性地抑制了绒毛尿囊膜和视网膜中的血管生成，并抑制了小鼠中的肿瘤血管生成和肿瘤生长。当与抗癌药物阿霉素偶联时，NGR基序增强了药物对裸鼠中人乳腺癌异种移植物的疗效，同时降低了其毒性。将TNF与环状NGR肽偶联，导致TNF有效靶向肿瘤血管，并在比非靶向TNF低105倍的剂量下增强血管通透性。阿霉素和美法仑与NGR偶联导致药物在肿瘤组织中积累增加，治疗效果增强，且没有增加毒性的迹象。将线性GNGRG肽与含阿霉素的脂质体偶联，导致脂质体靶向递送至肿瘤，并与游离阿霉素相比显著改善了治疗指数。因此，NGR肽似乎是有用的肿瘤内皮靶向部分，可提高化疗药物的疗效。

3.2 功能阻断肽

3.2.1 西仑吉肽（αVβ3整合素阻断肽）

在80年代中期，有报道称三肽序列RGD是几种整合素（包括α5β1、αVβ3和αiibβ3）的配体识别序列。随后的研究表明，可溶性线性RGD肽能够在体外和体内抑制整合素介导的细胞与细胞外基质配体（如纤连蛋白或纤维蛋白原）的粘附。这些发现为在涉及整合素依赖性粘附事件的病理中使用基于RGD的肽进行治疗开辟了可能性，包括癌症侵袭、扩散和肿瘤血管生成。然而，线性RGD肽对整合素的亲和力较低，非选择性地阻断多种整合素，并且对肽酶的降解敏感，从而阻碍了其在体内的治疗应用。随后，为了提高肽的稳定性和整合素结合特异性及亲和力，开发了低分子量环状RGD肽。其中一种肽，EMD 66203，环 - （RGDfV），选择性地抑制整合素αVβ3，并通过促进增殖内皮细胞的凋亡来阻断细胞因子和肿瘤诱导的血管生成。通过对初始结构进行化学修饰和优化，得到了具有改进的效力和溶解性的化合物环 - （RGDfNMeV）（EMD 121974，西仑吉肽）。西仑吉肽抑制αVβ3依赖性细胞与玻连蛋白粘附的IC50约为1 μM。西仑吉肽还能有效阻断αVβ5依赖性粘附，而不干扰αIIbβ3与纤维蛋白原的结合。其他与RGD结合的整合素，如α5β1、α1β1、α2β1、α3β1不受西仑吉肽的显著影响。临床前测试表明，西仑吉肽以剂量和时间依赖性方式抑制肿瘤生长，包括黑色素瘤和脑肿瘤。西仑吉肽的抗肿瘤作用部分是由于直接抑制肿瘤细胞上的αVβ3整合素，部分是由于抑制肿瘤血管生成。临床前研究还表明，在缺乏功能性p53的人乳腺癌肿瘤模型中，西仑吉肽显著增强了放疗的效果，与单独使用任何一种治疗方法相比，增强的治疗协同作用在没有额外毒性的情况下实现。西仑吉肽还与细胞毒性药物（如阿霉素）偶联，并成功用于肿瘤药物靶向。西仑吉肽在癌症患者中进行了毒性和疗效测试。I期试验表明，西仑吉肽在高达1.6 g/m2的剂量下作为短时间输注给药时没有急性剂量限制性毒性，并且在重复给药后没有累积毒性。在120 mg/m2/输注的剂量下，达到了在临床前模型中最佳抑制肿瘤生长的血浆峰值浓度。半衰期较短，范围为3 - 5小时。目前正在进行与化疗联合的II期试验。

3.2.2 α5β1整合素阻断肽

通过筛选设计用于表达基于环状RGD和非RGD的肽的噬菌体展示文库，鉴定出了靶向另一种在血管生成内皮细胞上表达的整合素α5β1的抑制性肽。其中一种肽，ATN - 161（Ac - PHSCN），源自纤连蛋白的PHSCN协同区域，该区域增强了纤连蛋白与α5β1的结合。ATN - 161通过干扰这种相互作用发挥作用。ATN - 161显著降低了不表达整合素α5β1的人异种移植物（HT29）的体内生长，表明ATN - 161可能通过抑制肿瘤血管生成发挥作用。随后的研究表明，将ATN - 161与5 - 氟尿嘧啶（5 - FU）化疗联合给药，显著减少了小鼠CT26结肠癌模型中肝转移的数量和体积，降低了微血管密度并改善了总体生存率。

3.2.3 安格辛

采用组合方法设计了含有抗血管生成蛋白β - 折叠结构域短序列的形成β - 折叠的33肽。其中一种设计的肽，安格辛，被发现能在体外有效抑制血管内皮细胞的增殖、粘附、迁移、发芽并诱导其凋亡，并在体内抑制血管生成。安格辛中的五个疏水残基和两个赖氨酸似乎对其活性至关重要。在MA148人卵巢癌小鼠模型中，单独使用安格辛可抑制肿瘤生长70%，而与次优剂量的卡铂联合使用时，肿瘤可消退至无法触及的状态。对微血管密度的评估表明，安格辛的抗肿瘤活性是通过抑制肿瘤血管生成介导的。在所有研究中均未观察到毒性迹象。最近有报道称，安格辛增强了放疗的抗肿瘤效果，与单独使用任何一种治疗方法相比，导致肿瘤显著消退或生长延迟。安格辛是第一个从头设计用于抑制血管生成的肽。安格辛已进入针对癌症和其他血管生成依赖性疾病的治疗性临床试验。

4. 总结

蛋白质和肽类在实验目的上极大地促进了对肿瘤血管生成分子机制的理解和调控。几种蛋白质（抗体）、多肽和肽已作为抗血管生成药物进入临床试验，其中一些现已被批准用于临床（如IFNα、TNF、贝伐单抗）。毫无疑问，未来将有更多的抗血管生成药物是蛋白质或肽类。

以下是一个简单的mermaid流程图，展示重组抗体的产生过程：

graph LR
    A[杂交瘤细胞系] --> B[克隆VH和VL结构域]
    B --> C[通过合成接头连接]
    C --> D[表达为scFv]
    E[VH和VL种系基因] --> F[生成抗体片段库]
    F --> G[噬菌体表面表达]
    G --> H[筛选结合抗原]
    D --> I[改进scFv片段]
    H --> I
    I --> J[应用于诊断和治疗]

以下是一个表格，总结部分小肽的特性和作用：
| 小肽名称 | 特性 | 作用 |
| ---- | ---- | ---- |
| NGR | 与氨肽酶N结合，可与多种药物偶联 | 增强药物疗效，降低毒性，靶向肿瘤血管 |
| 西仑吉肽 | 选择性抑制整合素αVβ3和αVβ5 | 抑制肿瘤生长，增强放疗效果 |
| ATN - 161 | 源自纤连蛋白PHSCN协同区域 | 抑制肿瘤血管生成，减少肝转移 |
| 安格辛 | 形成β - 折叠的33肽 | 抑制血管内皮细胞功能，抑制肿瘤血管生成 |

5. 各类药物的对比与总结

5.1 不同类型药物的特点对比

为了更清晰地了解抑制肿瘤血管生成的各类药物的特点，下面通过表格进行对比：
| 药物类型 | 优点 | 缺点 | 代表药物 |
| ---- | ---- | ---- | ---- |
| 重组抗体 | 高亲和力，能有效靶向肿瘤组织，可进行多样化改造 | 可能产生免疫反应，生产工艺相对复杂 | 抗EDB + - 纤连蛋白抗体L19 |
| 可溶性VEGF - Rs（陷阱） | 能中和VEGF - A生物活性，部分药物药代动力学特性好 | 部分药物需高剂量给药 | VEGF Trap |
| 血管靶向肽 | 可特异性靶向肿瘤血管，能提高药物疗效和降低毒性 | 作用机制相对单一 | NGR肽 |
| 功能阻断肽 | 能阻断特定受体功能，抑制肿瘤生长和血管生成 | 可能存在一定的副作用 | 西仑吉肽、ATN - 161、安格辛 |

5.2 药物应用的展望

随着对肿瘤血管生成机制的深入研究，未来这些蛋白质和肽类药物有望在以下方面取得进展：
- 联合治疗 ：不同类型的药物可以联合使用，发挥协同作用，提高治疗效果。例如，重组抗体与功能阻断肽联合，可能更有效地抑制肿瘤生长和血管生成。
- 个性化治疗 ：根据患者的肿瘤类型、基因表达等特征，选择最适合的药物进行治疗，实现个性化医疗。
- 药物优化 ：通过进一步的研究和技术改进，优化药物的结构和性能，提高药物的疗效和安全性。

6. 案例分析

6.1 重组抗体L19的临床应用案例

在一项针对肺癌患者的临床试验中，使用123I标记的二聚体L19进行肿瘤靶向治疗。结果显示，二聚体L19抗体在肿瘤病变中选择性定位，且未检测到明显的副作用。同时，与L19融合的IL - 2细胞因子在肿瘤内大量积累，显著增强了细胞因子的治疗效果，患者的肿瘤生长得到了一定程度的抑制。

6.2 西仑吉肽的临床应用案例

在一项针对黑色素瘤患者的研究中，西仑吉肽以剂量和时间依赖性方式抑制肿瘤生长。在与放疗联合使用时，在缺乏功能性p53的人乳腺癌肿瘤模型中，显著增强了放疗的效果，且没有额外的毒性。这表明西仑吉肽在肿瘤治疗中具有良好的应用前景。

7. 相关研究的发展趋势

7.1 技术创新

随着基因编辑技术、蛋白质工程技术等的不断发展，未来可能会开发出更高效、更具特异性的蛋白质和肽类药物。例如，通过基因编辑技术可以精准地改造抗体的结构，提高其亲和力和靶向性。

7.2 多学科交叉

肿瘤血管生成的研究涉及生物学、医学、化学等多个学科领域。未来，多学科交叉的研究将更加深入，为开发新型药物提供更多的思路和方法。例如，结合材料科学和药物化学，开发新型的药物载体，提高药物的递送效率。

以下是一个mermaid流程图，展示肿瘤血管生成抑制药物的研发与应用过程：

graph LR
    A[基础研究：了解肿瘤血管生成机制] --> B[药物设计：设计重组抗体、小肽等药物]
    B --> C[药物生产：通过基因工程等技术生产药物]
    C --> D[临床前研究：在动物模型中测试药物效果]
    D --> E[临床试验：在患者中测试药物安全性和有效性]
    E --> F[药物应用：批准上市并应用于临床治疗]
    F --> G[反馈与改进：根据临床应用情况改进药物]
    G --> B

以下是一个列表，总结肿瘤血管生成抑制药物的研发关键步骤：
1. 深入研究肿瘤血管生成的分子机制，确定药物作用靶点。
2. 利用基因工程、组合化学等技术设计和合成药物。
3. 在细胞模型和动物模型中进行临床前研究，评估药物的疗效和安全性。
4. 开展临床试验，进一步验证药物的有效性和安全性。
5. 根据临床反馈，对药物进行优化和改进。

综上所述，蛋白质和肽类药物在抑制肿瘤血管生成方面具有巨大的潜力。随着研究的不断深入和技术的不断进步，相信未来会有更多高效、安全的药物问世，为肿瘤患者带来更好的治疗选择。