电化学触发rGO递送替莫唑胺

基于还原氧化石墨烯的电化学刺激方法用于替莫唑胺递送

摘要

将药物分子可控释放到特定脑肿瘤组织已被公认为治疗脑癌最具挑战性的研究之一，因为它有助于避免全身药物递送技术带来的副作用。在本研究中，描述了一种使用还原氧化石墨烯‐药物复合物的电化学控制的药物递送方法。还原氧化石墨烯（rGO）负载替莫唑胺（TMZ）分子（rGO‐TMZ）后，在0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中表现出电化学氧化和还原峰。在施加电化学电位时，rGO‐TMZ复合物会释放 TMZ药物，且可通过调节电化学电位的时间来调整TMZ药物剂量。当施加0.8 V的电化学电位脉冲持续20分钟时，最多有83%的TMZ被释放到pH 5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中。体外细胞培养实验证明，所释放的TMZ药物保持其生物活性。这种电化学控制的 rGO‐TMZ复合物药物递送平台使其成为按需药物递送治疗脑癌的极具前景的候选方案。

关键词

还原氧化石墨烯，药物递送，替莫唑胺，电化学触发释放，可控释放。

1. 引言

脑肿瘤是起源于大脑内部的异常细胞团。脑肿瘤有多种类型。某些类型的脑肿瘤是非癌性的（良性），而另一些类型的脑肿瘤是癌性的（恶性）。恶性脑肿瘤死亡率高，年发病率为每年每10万人中有7.2例 [1,2]。胶质母细胞瘤是一种起源于星形胶质细胞或支持性脑组织的侵袭性癌症。胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最严重的脑肿瘤。这些恶性（癌性）脑肿瘤具有高增殖率、肿瘤组织病理学的多变性，并沿血管网络弥漫性浸润邻近脑组织 [3,4]。胶质母细胞瘤是人类主要的危险性癌症之一，在初次确诊癌症后，即使接受最大治疗，平均存活率也低于两年 [5]。

胶质母细胞瘤具有指状突起，因此通过手术完全切除极为困难。对于无法通过手术切除的胶质母细胞瘤，通常采用放疗和化疗来抑制其生长。然而，复发性胶质母细胞瘤尚无标准临床治疗方法[6]。当前常规治疗方案旨在延长患者生存预期，主要采用手术切除联合辅助放疗和/或口服替莫唑胺（TMZ）化疗[7]。尽管如此，肿瘤复发仍不可避免，导致中位生存期约为14个月，五年生存预期低于10%[8]。目前提高脑肿瘤治疗效果的主要障碍之一是血脑屏障的存在，它阻碍了药物分子的输送[9]。不幸的是，大多数化疗药物均无法满足这些要求；在采用口服或静脉注射给药时，往往在达到肿瘤周围区域的治疗有效药物浓度之前，就已经出现全身毒性[10]

因此，将高效药物浓度可控递送至特定靶向肿瘤附近区域是药物给药领域中关键且具有挑战性的研究之一。为了解决这些问题，科研人员一直在研究纳米材料 [11],纳米载体 [12],聚合物 [13],薄膜 [14]和水凝胶 [15]这些材料通过外部刺激发挥作用，具有实现可控药物递送的潜力。此外，光激活 [16, 17],温度 [18],超声 [19],磁场 [20],机械应力[21],葡萄糖 [22]和pH变化 [23]的药物释放方法也已被研究。特别是利用电刺激方法实现靶向药物释放，已广泛采用聚两性电解质水凝胶 [24],聚吡咯 [25, 26],聚合物凝胶 [27]和氧化石墨烯复合膜 [28]进行研究。

电化学触发的药物释放是指对适当物质实现可控剂量的最便捷且技术上简单的途径[29‐31]。有趣的是，已有研究通过使用导电纳米颗粒[32], ，在聚合物基质[33],中通过电化学状态变化[34]调控孔径，并还原交联Fe3+离子，来实现药物或生物分子释放的电化学刺激技术。此外，据报道，带电药物分子的电化学刺激释放机制依赖于静电吸引和排斥力[35]。近年来，还原氧化石墨烯（rGO）材料因其大比表面积和优异的电化学性能已被用于高效载药和可控释放系统[28, 36‐38]。rGO在载药和释药过程中起着非常重要的作用，因为rGO可通过疏水性、氢键、静电相互作用和/或 ‐堆积与药物产生不同的结合能力，从而形成对rGO基质的界面；这些界面对外部电刺激敏感 [38, 39]。

替莫唑胺（TMZ）是一种常用于治疗胶质母细胞瘤的口服药物，能够穿过血脑屏障。TMZ是一种烷化剂，这些烷化物通过将甲基传递至DNA的嘌呤碱基（N7‐鸟嘌呤、 O6‐鸟嘌呤和N3‐腺嘌呤）来抑制DNA复制[40]。TMZ药物具有快速降解和短血浆半衰期（1.8小时）的特点，将TMZ药物包封到纳米材料中有利于实现TMZ药物的可控、稳定和持续释放，从而抑制肿瘤细胞生长，已有多种纳米材料被研究，列于下表中。1[4, 41-55]。此外，

与口服给药相比，局部递送TMZ药物的优势已在啮齿类动物胶质母细胞瘤模型中得到证实 [47,56]。

此外，与单独使用替莫唑胺治疗相比，电刺激（瘤内调制疗法（IMT））联合替莫唑胺药物递送系统治疗可进一步增强对胶质母细胞瘤（GBM）细胞生长的抑制作用 [57]。另外，最近报道的结合可控药物递送植入装置的电刺激为那些无法通过传统医学治疗治愈的患者提供了替代医学方案[58,59]。因此，制备一种适用于电化学控制并实现药物稳定释放的合适电极，是当前一项具有挑战性且关键的研究。据我们所知，此前尚未有利用电化学激活释放替莫唑胺（TMZ）的尝试。本文重点在于制备一种合适的还原氧化石墨烯电极（如方案1所示），该电极具备负载更高浓度TMZ的能力，并可通过电化学触发方法实现对TMZ的可控和稳定释放。

2. 实验

2.1. 材料、试剂与溶液

所有试剂均为高纯度级别；替莫唑胺（TMZ）（>98%）购自J&K有限公司（中国上海），其他所有试剂均来自Strem Chemicals.Inc（美国新伯里波特）。Na2HPO4来自北京索莱宝科技有限公司（中国北京），柠檬酸来自Aladdin Industrial Corporation（中国上海），NaH2PO4也来自Aladdin Industrial Corporation（中国上海）

将1mM TMZ的储备溶液溶于去离子水并保存在 4 oC下以备后续使用。使用默克密理博Milli‐Q系统的纯化水配制不同pH/组成（5.0/柠檬酸+NaH2PO4 , 7.0/柠檬酸+NaH2PO4 , 9.0/ Na2HPO4 + HCl）的支持电解质溶液。所有实验均在室温（25±1 oC） 下进行。

2.2. 替莫唑胺‐还原氧化石墨烯电极的制备

rGO–TMZ的制备分为两步。首先，从蔡贤处获得rGO样品，该样品是根据蔡贤先前报道的方法合成的[42]。将Temozolomide（TMZ）通过振荡混合rGO（1 mg ML-1）和TMZ（100 g L-1）在pH 5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中约45分钟，使其杂化到还原氧化石墨烯纳米片上。其次，将得到的rGO–TMZ杂化样品在12,000 转/分钟条件下离心约15分钟，去除未结合的TMZ分子，并将大部分产物重新分散于pH 5.0柠檬酸盐缓冲溶液中，再次进行离心收集，此洗涤步骤至少重复两次，最终得到rGO–TMZ样品。

2.3. 表征

采用循环伏安法（CV，上海辰华仪器公司）、紫外‐可见分光光度法（使用岛津 UV‐2505分光光度计（京都，日本）监测紫外‐可见光谱）和拉曼光谱法（使用堀场 HR800拉曼光谱仪系统，采用100物镜聚焦激光束并收集拉曼信号）对rGO–TMZ样品进行表征，并通过扫描电子显微镜（日立S‐8100场发射扫描电子显微镜，日本）和透射电子显微镜（TEM，Tecnai F 20，FEI）观察rGO–TMZ样品的形貌。

2.4. 电化学方法

电化学测量使用上海辰华仪器公司（CH Instruments, Inc., Shanghai）的 CHI660D电化学分析仪进行。采用三电极体系，其中金电极（GCE，几何面积= 0.07 cm2）作为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极，铂丝作为对电极。通常将rGO–TMZ样品分散于pH 5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中，振荡15分钟形成均匀油墨。然后取 10 l该分散液滴涂在直径为三毫米的玻碳电极上。在金电极表面的 rGO‐TMZ杂化材料用一层壳聚糖薄膜（1% 壳聚糖溶液）进行保护。

2.5. 细胞培养与活性

人胶质瘤LN229细胞系购自中国医学科学院上海细胞库（上海，中国）。LN229细胞在含10%胎牛血清（FBS）、1% L‐谷氨酰胺、1%链霉素和1%青霉素储备溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，Gibco）中培养，于37°C、5% CO2的培养箱中培养48 h。

细胞活力通过CCK‐8实验（Dojindo）测定。将100微升LN229细胞接种于96孔板 （5 × 103个细胞/孔）中，培养48小时。在不同浓度的替莫唑胺（TMZ，J&K公司） （浓度范围为0至2000 μM）处理下，分别加入到细胞培养基中。在另一组实验中，细胞分别在含TMZ溶液（62.5 M）以及rGO‐TMZ杂化材料释放的TMZ溶液（62.5 M）的培养基中培养。未添加TMZ的培养基中的细胞作为对照组。培养48小时后，每孔加入10%的CCK‐8溶液，并在37 0°C孵育1小时。使用酶标仪（PerkinElmer）在450 nm处测定各孔的光密度（OD）。细胞活力（对照组的百分比）表示为（ODtest －ODblank）/（ODcontrol － ODblank）的百分比，其中ODtest为暴露于TMZ的细胞的光密度，OD control为对照组样品的光密度，ODblank为不含LN229细胞的孔的光密度。

3. 结果与讨论

3.1 表征

将含有100 克/毫升-1 TMZ的rGO‐TMZ复合溶液滴涂在金电极上。裸金和涂覆有 rGO‐TMZ的金电极的循环伏安法（CV）如图1（A）所示。裸金电极的CV曲线未显示电容性，而涂有rGO的金电极由于存在rGO而表现出较大的电容性。在金电极上涂覆 rGO‐TMZ的CV曲线中，约在‐0.23V处出现一个明确的氧化峰，在‐0.74V处出现一个还原峰，这是由于TMZ分子与rGO结合所致。

在pH 7.4的0.1M PBS溶液中，电压范围为‐0.9至0.9 V，扫描速率为100 mVs-1 时的循环伏安图。(B) 紫外‐可见吸收光谱，(C) 拉曼光谱。以及(D) 扫描电子显微镜图像，(E) 替莫唑胺‐还原氧化石墨烯复合物的透射电子显微镜图像)

图1（B）显示了分散在柠檬酸盐缓冲溶液（pH 5.0）中的rGO和rGO‐TMZ复合物的紫外‐可见吸收光谱。rGO‐TMZ复合物在325纳米处显示出一个强峰，对应于 TMZ分子与rGO的静电相互作用，而裸rGO在325纳米处无吸收峰。这表明TMZ分子已与rGO结合。

拉曼光谱法是一种研究碳基纳米材料结构和纯度的良好技术。图1C (b) 显示了纯 TMZ药物的拉曼光谱，其与先前报道的替莫唑胺拉曼光谱相似。图1C (a) 和(c) 显示了金包覆的还原氧化石墨烯和rGO‐TMZ复合电极的拉曼光谱，其中还原氧化石墨烯显示出典型的D峰(~ 1347 cm-1)和G峰(~ 1598 cm-1)，归属于sp2石墨化结构。而金包覆的 rGO‐TMZ复合物在D峰(~1349 cm-1)和G峰(~ 1596 cm-1)上表现出轻微变化，表明 rGO‐TMZ存在局部缺陷/无序，这可能是由于替莫唑胺分子的‐电子与还原氧化石墨烯的‐电子之间的静电相互作用所致。D峰和G峰的相对强度比(ID/IG)的变化是确定碳基结构中sp2域尺寸的一个有用参数[62, 63]。rGO‐TMZ复合物的ID/IG比值（1.36）高于还原氧化石墨烯（1.07）。这表明形成了新的（或更多的）石墨域，sp2簇数量增加[64], ，意味着还原氧化石墨烯上的缺陷增多[65], ，电子共轭状态以及sp2域尺寸发生变化；这可能是由于替莫唑胺分子与还原氧化石墨烯基质发生堆叠所致。此外，2D带是此前报道过的用于判断片层堆叠情况的一个有用参数[28]。还原氧化石墨烯片层表现出典型但不清晰的2D峰，而rGO‐TMZ复合物在2951、3155、3616 cm-1处显示出典型的2D峰。就rGO‐TMZ复合物而言，其2D峰波数相较于通常报道的还原氧化石墨烯2D峰在拉曼光谱中的位置发生了偏移[38], ，这表明rGO‐TMZ复合物相比还原氧化石墨烯具有更多的多层结构[38]。此外，在477 cm-1处观察到的峰可能归因于 rGO‐TMZ复合样品中替莫唑胺分子的CCN和仲胺弯曲[66, 60]。而在3445 cm-1处观察到的小峰可能是由于rGO‐TMZ复合物中替莫唑胺分子伯胺的伸缩振动所致[66,60]。这一证据进一步证实了替莫唑胺分子与还原氧化石墨烯样品发生了杂化。

图1中显示的替莫唑胺‐还原氧化石墨烯复合物的形貌，扫描电子显微镜图像（见图1（D））展示了替莫唑胺‐还原氧化石墨烯复合物的片状基质结构，透射电子显微镜图像（见图2（E））则说明了该复合物的片层结构。

3.2. TMZ药物负载

基于上述对替莫唑胺‐还原氧化石墨烯复合物的表征，替莫唑胺分子的轨道电子可能与还原氧化石墨烯的 轨道电子发生静电相互作用。这一概念有助于设计关于替莫唑胺分子在还原氧化石墨烯上载药容量的实验。通过在325纳米处进行紫外‐可见光谱测量，测定替莫唑胺（TMZ）溶液在负载前后浓度的变化，从而估算其载药容量，如图2(a)和(b)所示。实验发现，还原氧化石墨烯对替莫唑胺的载药容量为84%。

根据载药容量公式=[Co‐Csup/CrGO] X 100%，由该测量结果计算得出载药容量，其中 Co表示加入还原氧化石墨烯的替莫唑胺浓度（100 g mL-1），Csup表示与还原氧化石墨烯反应后上清液中替莫唑胺的浓度（通过紫外‐可见光谱法测定），CrGO表示还原氧化石墨烯的浓度（1mg mL-1）。在325纳米波长下，替莫唑胺在柠檬酸盐缓冲溶液pH 5.0中表现出特征吸收峰，其吸光度随替莫唑胺浓度的增加呈线性增长（见图2(c)和(d)）。在固定还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1）条件下，替莫唑胺浓度的优化实验显示载药容量具有浓度依赖性（见图2(e)）。在不同酸性pH溶液（pH 2至5）条件下，固定还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1）时，替莫唑胺的载药容量表现为pH无关性，如图2(f)所示。类似地，在不同时间间隔（15至75分钟）条件下，固定还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1）时，替莫唑胺的载药容量表现为时间依赖性，如图2(g)所示。

替莫唑胺（TMZ）负载到还原氧化石墨烯上后的上清液，(b) 柠檬酸盐缓冲溶液（pH 5.0），(d) 校准曲线。以及，(e) 在还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1）上的替莫唑胺浓度的载药容量，(f) 在替莫唑胺浓度上的载药容量在pH溶液（pH 2至pH 5）中还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1），以及（g）在不同时间间隔（15至75分钟）内替莫唑胺浓度在还原氧化石墨烯恒量（1 mg mL-1）上的载药容量)

3.3. TMZ药物递送

制备用于电化学控制和稳定释放TMZ药物的替莫唑胺‐还原氧化石墨烯复合物包覆电极，是当前一项具有挑战性且关键的研究，因为这关系到远程可控药物递送装置的开发。为确定rGO‐TMZ薄膜在0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中的电化学TMZ释放情况，

相对于饱和甘汞电极（SCE），在0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液（酸性，pH 5.0）中施加从‐0.8到0.8 V的电化学脉冲。rGO‐TMZ复合物中TMZ的释放表现出pH依赖性（见图 3(B)和(b)）。在固定时间（20分钟）和电位（0.8 V）下，rGO‐TMZ复合物在柠檬酸盐缓冲溶液（pH=5）中的电化学触发释放比在中性pH和碱性pH缓冲溶液中更为显著。可以理解的是，在酸性条件（pH 5.0）下，TMZ因其氨基的质子化[67]而带正电荷。因此，酸性pH应对TMZ从rGO‐TMZ电极上的解吸产生显著影响。rGO‐TMZ电极在酸性条件下激活TMZ释放，使得该材料在可控药物递送应用中具有吸引力，因为肿瘤细胞外环境以及细胞内溶酶体和内体均为酸性环境[51]。

图3 (A) &(a) 显示了在施加相对于SCE为‐0.8 V、0 V和+0.8 V的电位时，替莫唑胺从rGO‐TMZ基质中在固定时间（20分钟）内向0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中的电化学释放。结果明显表明，在正电位偏压下（见图3 (A) &(a)），电化学释放更为显著，此时实现了~83± 2%的替莫唑胺释放。此外，在未施加电位的情况下，替莫唑胺在固定时间（20分钟）内从rGO‐TMZ基质向0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中发生了轻微的被动扩散，这可能是由于在酸性条件下，替莫唑胺的NH2基团发生质子化而使其亲水性增强所致。通过紫外/可见吸收光谱法测定了在20分钟内向0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中随时间释放的替莫唑胺量。图3(C) &(c) 显示了在施加电化学电位（0.8 V）后，替莫唑胺在0.1 M柠檬酸盐缓冲溶液(pH 5.0)中的解吸动力学，所得结果表明，rGO‐TMZ复合物中替莫唑胺的释放具有时间依赖性。在对rGO‐TMZ复合物施加0.8 V电位持续20分钟后，药物释放曲线趋于基本恒定或下降，这表明替莫唑胺‐还原氧化石墨烯基质膜中已无更多药物可释放。

已有研究人员报道，石墨烯及其衍生物可通过 π‐π堆积相互作用作为某些富含 π轨道药物的药物载体[67‐70]。因此，此处TMZ在结构中具有较大的平面富含π轨道区域（如方案1所示），有利于其 facile 地附着在石墨烯表面。此外，在低pH条件下，TMZ在酸性条件下，由于其NH2基团质子化为带正电荷的NH 3+阳离子，使其亲水性增强，通过施加正电位至替莫唑胺‐还原氧化石墨烯电极[67]，可借助静电排斥作用使替莫唑胺分子从石墨烯表面易于解吸。此外，在替莫唑胺‐还原氧化石墨烯电极表面附近施加正电化学电位会引发水的氧化，产生更多的H+离子浓度，从而加速替莫唑胺释放[39]。因此，在替莫唑胺‐还原氧化石墨烯基质上施加正电荷将使界面带正电，导致替莫唑胺的–堆叠相互作用减弱。

3.4. 细胞活性

替莫唑胺（TMZ）药物已获批用于治疗复发性胶质瘤、黑色素瘤及某些实体肿瘤。通过将药物添加至LN229细胞中评估其生物活性。图4a显示了通过CCK‐8实验检测的 LN229细胞的细胞毒性。将LN229细胞接种于96孔板中，用不同浓度的药物（从0到 2000 μM）处理48小时，并通过CCK‐8方法进行细胞毒性检测。LN‐299胶质瘤细胞在使用浓度增加的TMZ处理后的存活率。肿瘤LN‐299细胞在62.5 M浓度下被TMZ显著抑制。TMZ药物浓度增加导致LN229细胞存活率降低。为了验证rGO‐TMZ界面的电化学电位对TMZ药物的生物活性无影响，测试了TMZ药物在电化学释放前后的生物活性。 图4b显示了TMZ药物（62.5 M）以及从rGO‐TMZ薄膜中获得的TMZ药物 （62.5 M）对人胶质瘤LN229细胞的生物活性。通过电化学触发（0.8伏持续20分钟）从rGO‐TMZ薄膜释放的TMZ药物（62.5 M）对肿瘤LN‐299细胞的抑制作用与作为标准的TMZ药物（62.5 M）相似。这些数据表明，TMZ在rGO上的负载过程以及电化学触发释放并未明显改变替莫唑胺分子的生物活性，因此rGO被认为是用于替莫唑胺药物载体系统并通过电化学触发方法释放的一种极具吸引力的纳米模板。

4. 结论

我们已开发出一种简便高效的基于还原氧化石墨烯（rGO）的电化学触发的替莫唑胺控释递送系统。rGO材料表现出作为替莫唑胺分子非共价–堆叠相互作用负载的良好平台。rGO‐TMZ复合物展现出电化学触发的替莫唑胺释放特性。在酸性pH条件下，涂覆于金电极表面的rGO‐TMZ薄膜在0.8V（相对于SCE）电位下持续20分钟时，表现出最佳的替莫唑胺释放效果，且其释放能力呈电位依赖性。施加电位的大小、施加时间以及电解质的pH值是影响rGO‐TMZ基质薄膜涂覆金电极释放TMZ的关键参数。体外细胞培养实验表明，通过电化学触发（0.8伏持续20分钟）从rGO‐TMZ基质薄膜释放出的TMZ药物仍保持其生物活性。我们预计该系统能够以远程且可便捷控制的方式递送药物分子，因此被认为是一种极具吸引力的用于替莫唑胺药物载体系统的rGO 纳米模板。此外，可控药物递送电极对于先进生物医学器件的开发非常有用，例如：生物电子学、电药物以及可远程控制的植入式药物递送装置[59],等。

材料	&体内癌症	亮点	Ref
聚(ε‐己内酯) 聚二氨醇酯基（PCL‐Diolb‐PU）	体外研究使用U‐ 87 MG细胞	实现TMZ持续释放 30天来自PCL‐Diolb‐的核鞘 具有TMZ核心的PU纳米纤维。	41
聚(ε‐己内酯)(PCL)	体外研究使用U‐ 87 MG细胞	TMZ-PCL表现出 显著 更强的 诱导凋亡的能力，相较于TMZ单独使用。	42
聚乳酸‐羟基乙酸共聚物（PLGA）， Poly(D,L‐lactic acid) 聚(D,L‐乳酸) (聚乳酸)，聚己内酯	携带C6的体外研究， U87细胞 & 携带C6的体内研究 Wistar大鼠	在动物体内植入并给予1个月替莫唑胺 药物释放显示近4个月 存活率为85.7%的动物，而7‐ 天TMZ药物释放植入物 导致54.6%的动物出现肿瘤复发 中位生存期为 74天。	43
聚(ε‐己内酯) PCL	体外研究与C6 胶质瘤细胞	集成替莫唑胺掺杂的（聚己内酯）纳米纤维 膜和神经生长因子包被的 聚己内酯膜使用海藻酸钠 水凝胶对C6胶质瘤表现出抑制作用 PC12细胞生长和分化 神经元 ce lls ove r four weeks	44
PCL‐二醇‐b‐聚氨酯 壳聚糖 NPs,壳聚糖 (CS)纳米颗粒 (NPs)	U‐的体外研究 87细胞	嵌入到 PCL‐二醇‐b‐聚氨酯中并包覆金纳米粒子的CS/TMZ纳米颗粒 显示出对U‐87胶质母细胞瘤的抑制作用 细胞生长。	45
聚(ε‐己内酯 二醇基 聚氨酯（PCL‐Diol‐b‐PU）	体外研究使用U‐ 87细胞	TMZ和金纳米粒子被整合到 PCL‐二醇‐b‐聚氨酯中，显示出对 胶质母细胞瘤治疗的有效性。	46
聚丙烯 碳酸盐 ( PPC) Ca‐ 海藻酸微球	体外研究使用 胶质瘤C6细胞	细胞毒性试验表现出最佳 协同效应，当质量比为 紫杉醇：TMZ 1:1 载药。	47
PLGA：增塑剂 (40:60) 聚乳酸‐ 羟基乙酸共聚物) ( PLGA)	大鼠胶质瘤切除 模型和皮下 人源异种移植胶质瘤 模型	可生物降解凝胶基质‐TMZ，凝胶‐ matrix‐TMZ 表现出良好的耐受性且 对减少肿瘤 细胞有 效。	48
聚乙二醇 二甲基丙烯酸酯（PEG‐ DMA）和水 (75:25)	体内研究 U87MG subcutaneous GBM xenograft model	PEG‐DMA 可注射水凝胶表现出 持续和局部递送的替莫唑胺。该 经处理的小鼠的肿瘤重量 光聚合替莫唑胺水凝胶 显著降低。	4
单甲氧基聚乙二醇‐ 聚乳酸‐羟基乙酸共聚物纳米复合物 （聚乙二醇‐ 聚（乳酸‐co‐ 乙醇酸）	U‐87和C6细胞的体外研究 87和C6细胞 & 体内研究与 皮下接种U87的小鼠	紫杉醇（PTX）和替莫唑胺 （TMZ）（PTX:TMZ为1:5（重量比））药物‐ 负载于mPEG‐PLGA 纳米颗粒 （NPs）递送系统显著 抑制了肿瘤生长。	49
液晶聚合物 (LCP)	使用9L 胶质肉瘤细胞进行 植入F344大鼠皮下 F344 大鼠	载有替莫唑胺的液晶聚合物可植入药物 递送装置显示出释放替莫唑胺 显著延长存活率 在9L 胶质肉瘤攻击的大鼠中 与系统性递送 方法相比。	50
部分乙基化 聚（苹果酸）	U‐的体外研究 87‐MG 和 MDA‐MB468 细胞系	部分酯化的聚（苹果酸） 负载TMZ的纳米颗粒显示出 降解为苹果酸、醇和TMZ 药物释放，以及抑制 癌细胞 .	51
聚(d,l‐丙交酯‐co‐ 乙交酯) (PLGA) 微粒	体外研究中使用 胶质瘤C6癌细胞	微粒释放的TMZ显示出初期 突释，随后持续药物释放达 1个月。从PLGA 聚合物递送的TMZ显示出对胶质瘤的抑制作用 C6 癌细胞生长。	52
NP‐TMZ‐CTX 含有壳聚糖核心 负载替莫唑胺和 生物素（Chi‐TMZ‐Bt） 以及含有 CTX靶向配体 连接到AF647‐ 偶联 中性亲和素 [NA‐ AF647‐CTX)	体外研究与118 MG, SF767,和GBM6 细胞。 & 体内研究中使用 C57BL6野生型小鼠	NP‐TMZ‐CTX纳米颗粒表现出 对胶质母细胞瘤细胞更有效的抑制 比游离药物更具优势。NP‐TMZ‐CTX 能够穿过血脑屏障并将TMZ药物 递送至大脑的血管区域。	53
氧化锌 (ZnO) 纳米颗粒	87 胶质母细胞瘤细胞	通过溶剂法提取药物 蒸发。负载替莫唑胺的ZnO纳米颗粒 显示出增强了细胞活力。	54
乳铁蛋白 纳米颗粒	体外研究与 GL261细胞	载有替莫唑胺的乳铁蛋白纳米颗粒（TMZ‐ LfNPs）采用溶剂‐油法进行制备。 TMZLfNPs表现出显著的 肿瘤体积抑制作用、更高的肿瘤 细胞凋亡率以及延长的中位 荷胶质瘤小鼠的存活率。	55