LiP-MS实验入门：从原理到操作，这份「可落地指南」帮你避开90%的坑

还在为蛋白结构变化检测发愁？想做药物靶标验证却找不到靠谱方案？今天给所有生物科研人带来一份「保姆级 LiP-MS 实验指南」—— 从原理到操作，从试剂到数据分析，每一步都标好关键细节，新手也能直接上手，让你轻松解锁结构蛋白质组学的强大功能！

一、LiP-MS 到底能解决什么问题？

简单说，LiP-MS（有限蛋白水解质谱）是把“看不见的蛋白构象变化”转化为“可量化的肽段数据”。

● 核心原理：用非特异性蛋白酶 K（PK）对蛋白做「有限水解」—— 当小分子（如药物）结合蛋白，会改变蛋白柔韧性和 PK 切割位点的可及性，导致处理组和对照组的肽段丰度出现差异。通过质谱检测这种差异，就能定位蛋白结构变化区域，还能定量分析小分子的靶标结合效果。

● 能做什么：小到药物靶标验证、结合位点定位，大到疾病相关蛋白构象异常分析，甚至别构效应研究，LiP-MS 都能精准覆盖，尤其适合复杂生物样本（如细胞裂解液），无需纯化蛋白，更贴近生理状态。

● 方案靠谱吗：本文核心流程基于 Schopper 等人 2017 年发表在《Nature Protocols》的经典方案，同时补充 Malinovska 团队 2023 年的高通量优化细节，兼顾 “可靠性” 和 “前沿性”，避免大家踩 “冷门方案” 的坑。

二、step-by-step 操作：5 步搞定 LiP-MS 实验

LiP-MS 实验整体流程示意图。

来源: Schopper, S. et al. Nature Protocols(2017)

步骤1：天然蛋白提取 

—— 保住 “蛋白活性” 是基础

核心是“避免蛋白变性”，记住３个关键：

❶ 细胞 pellet 冰上解冻，用 200μl LiP 缓冲液（1mM MgCl₂+150mM KCl+100mM HEPES）重悬，转移到 15ml Falcon 管；

❷ 电动匀浆器裂解：10 次脉冲（每次 1 分钟），中间间隔冰浴，别产生气泡（会氧化蛋白）；

❸ 4℃最大转速离心 15 分钟去碎片，上清用 BCA 试剂盒定量后，稀释到 2μg/μl，按 50μl / 管分装（每管含 100μg 蛋白），全程冰上放。

步骤 2：有限水解

 ——“精准计时” 是实验成败关键

LiP-MS 的 “灵魂步骤”，PK 切割模式的可重复性全靠时间控制，差 1 秒都可能导致结果不可用：

❶ 提前准备好药物 / DMSO 的 PCR 排管、0.2μg/μl 的 PK 排管（PK 必须冰上放）；

❷ 加 1μl 药物 / DMSO 到样品管，混匀后立即计时，25℃孵5分钟；

❸ 加 5μl PK，混匀后再次计时，25℃孵 5 分钟；

❹ 时间一到，立刻转移到 99℃ PCR 区孵 5 分钟灭活 PK，然后冰浴冷却至少5分钟。

Tips：所有样品必须 “同步操作”，比如先给所有样品加药，间隔 10 秒一个，确保后续孵育时间完全一致；绝对不能 “先处理完一组再处理另一组”，否则时间差会导致切割差异。

步骤 3：胰蛋白酶完全水解

 ——“去杂质 + 提肽段” 双目标

1.变性与还原：

将 56μl LiP样品转移到新管，加等体积10% DOC（脱氧胆酸钠）变性，再加 TCEP 至终浓度 5mM（约 2.87μl），37℃、800rpm 孵 40 分钟（打开二硫键）；

2.烷基化

加 IAA 至终浓度 40mM（约 4.79μl），30℃、800rpm暗室孵 30 分钟（避光防止分解）；

3.酶解与终止

用 100mM ABC 稀释 DOC 到 1%（算准体积，浓度太高会抑制酶活性），加 1μg Lys-C+1μg 胰蛋白酶，37℃孵过夜；次日加 50% 甲酸至终浓度 2% 终止反应，37℃振荡 5 分钟后，用 0.2μm PVDF 滤板过滤去DOC沉淀。

Tips：过滤时用 96 孔真空歧管，抽滤时间控制在 5 分钟，避免过度干燥导致肽段损失。

步骤 4：C18 净化

 —— 脱盐 + 除杂质，质谱数据更干净

1.C18 柱活化

依次用 1 倍体积甲醇、1 倍体积 Buffer B（50% 乙腈 + 0.1% 甲酸）淋洗，再用 2 倍体积 Buffer A（0.1% 甲酸）平衡，每步 500×g 离心；

2.上样

把消化后的样品加载到柱子上，500×g 离心，收集流穿液（万一回收率低还能重新上样）；

3.清洗：

用 3 倍体积 Buffer A 洗 3 次，去除盐和残留 DOC；

4.洗脱

用 100μl Buffer B 洗脱 2 次，合并洗脱液，45℃ SpeedVac 干燥 2-3 小时，-20℃保存。

步骤 5：肽段重悬 + 质谱检测

1.重悬

按 50% 回收率算，用 50μl Buffer A 重悬干燥肽段（约 1μg/μl），25℃振荡 5 分钟 + 超声 5 分钟，确保完全溶解；

2.离心

15℃、21130×g 离心 5 分钟，取 9μl 上清 + 1μl iRT 肽段，转移到质谱样品瓶；

3.质谱参数

色谱柱：自填 40cm×0.75μm C18 柱，1.9μm beads；

流动相：3%→35% 乙腈（含 0.1% 甲酸），120 分钟线性梯度，流速 300nl/min；

MS1：扫描 350-1500m/z，分辨率 120000，AGC 200%；

MS2：DIA 模式，20 个可变窗口（如 349.5-381.5m/z），HCD 碰撞能量 30%。

三、数据分析：别让 “丰度变化” 干扰 “结构变化”

LiP-MS 数据分析的核心，是区分 “肽段差异源于构象变化” 还是 “源于蛋白丰度变化”，这步做错会导致完全错误的结论：

❶ 软件选择：先用 Spectronaut 15 的 directDIA 功能鉴定定量肽段，再导出数据到 RStudio；

❷ 关键 R 包：

● 基础分析用 protti 包（归一化、过滤低质量肽段）；

● LiP-MS 专属用 MSstatsLiP 包，能校正蛋白丰度变化的影响，精准找出「结构变化导致的肽段差异」；

❸ 质控验证：阳性对照 ——10μM 雷帕霉素处理组，检查是否检测到 FKBP12（P62942）的肽段显著差异（火山图上能清晰看到），没差异就说明实验体系有问题，得回头排查。

四、新手必看：3 个避坑技巧

➢ PK 活性不足：表现为两组样品肽段无差异

解决方案：PK 配好后分装成 10μl / 管，-20℃保存，避免反复冻融；每次实验前用 BSA验证活性（25℃孵育5分钟，能看到明显降解）。

➢ 质谱信号弱：表现为肽段鉴定数 < 1000

解决方案：肽段重悬时多超声 5 分钟，确保完全溶解；若仍弱，检查色谱柱是否堵（可更换新柱测试）。

➢ 差异肽段少：表现为火山图上显著差异肽段 < 10 个

解决方案：调整药物浓度（1μM→10μM）或延长孵育时间（5min→7min），但别超过10min，避免非特异性结合。

五、参考文献与资源溯源

核心方案

Schopper, S. et al. Nature Protocols, 2017(https://doi.org/10.1038/nprot.2017.097)

高通量优化

Malinovska, L. et al. Nature Protocols, 2023 (https://doi.org/10.1038/s41596-022-00771-x)

数据分析工具

MSstatsLiP：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/MSstatsLiP.html

protti：https://github.com/jpquast/protti

实验方案数据库

Bio-protocol、Current Protocols（可查具体操作视频）