IP-MS 实验步骤

免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）原理介绍：

蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions，PPIs)和翻译后修饰( Post-Translational Modifications，PTMs）的数据是能显著提高基础类研究文章档次的重要内容。

IP-MS，即免疫沉淀（IP ，Immunoprecipitation)结合LC-MS（液相色谱-质谱联用，蛋白质组学研究的核心工具），是筛选和发现目的蛋白(target)在细胞中新的互作蛋白或者新的翻译后修饰的主流技术方案。

通过一次IP-MS实验，能高通量的鉴定和筛选到多个与要研究的目的蛋白（target）存在相互作用的蛋白质（蛋白质复合物组分），从而拥有属于自己的专属蛋白质相互作用数据库，能够进行更深入的生物学功能和分子机制的研究。

实验步骤

1. 用Lysis Buffer裂解细胞，可以适当加上超声辅助，或者在冰上放置30 min，每10 min吹吸一次细胞，直至看不见明显大的颗粒状细胞。

   参考用量：对于少于10 cm dish的细胞，用500 μL Lysis Buffer；对于一个10 cm dish的细胞，用1 mL Lysis Buffer；对于一个15 cm dish的细胞（2e7个细胞），用2 mL Lysis Buffer。

2. soft模式4 ℃，20,000 ×g 离心15 min。

3. 转移上清到新的1.5 mL管中，加入适量的抗体。

   参考用量：少于一个10 cm dish的细胞，加入1 μg抗体；对于一个10 cm dish的细胞，加入2 μg抗体；对于一个15 cm dish的细胞，加入5 μg抗体。

4. 将EP管在4 ℃颠倒混匀至少2小时。

5. soft模式4 ℃，20,000 ×g 离心15 min。

6. （在第5步离心的时候）将磁珠用Lysis Buffer平衡三次。

7. 取第5步的上清液转移到新管，并加入适量的磁珠。

   参考用量：对于少于一个10 cm dish的细胞量，需要加入5 μL实体beads；对于一个10 cm dish的细胞量，加入5 μL实体beads；对于一个15 cm dish的细胞量，加入15 μL实体beads。

8. 将EP管在4 ℃颠倒混匀至少2个小时，或者过夜。

9. 在磁力架上静置1 min分离磁珠，去掉上清溶液；或1000 ×g离心2 min 分离琼脂糖珠子，去掉上清溶液。

10. 加入1 mL Wash Buffer颠倒混匀后，在磁力架上静置1 min分离磁珠，去掉上清溶液；或1000 ×g离心2 min 分离琼脂糖珠子，去掉上清溶液。重复清洗至少三次。

11. 加入置换液（150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5）或PBS冲洗磁珠三次，最后一次清洗分1/4体积beads混合溶液至新EP管用于进行WB和SDS-PAGE染色验证。

12. 剩余3/4 beads混合溶液，去掉上清，仅保留干beads沉淀；-20 ℃暂存或送测质谱。

13. 1/4 beads混合溶液去掉上清液，加入50 μL Loading Buffer煮沸10分钟，离心后取上层溶液。

14. 分别取20 μL样本跑两块SDS-PAGE胶，分别进行WB实验和考染/银染染色。

15. WB显示有目的蛋白条带；考染/银染显示有目的蛋白条带，实验组和对照组均有大量条带，表明IP实验过程正常。

说明

1、Lysis Buffer和Wash Buffer成分一样，各实验室略有差别，一般如下（仅供参考）：

2、WB是靶向的检测并且经过了抗体的多级放大，理论上比质谱非靶向性的检测灵敏度要更高，所以需要做质谱的IP实验应该提高细胞量，高质量的IP-MS文章通常使用1e8（约10 cm dish x 10或15 cm dish x 5）的细胞起始用量。我们推荐野生型IP起始细胞量不低于2e7/样本，针对过表达的标签目的蛋白或表达量较高的内源性目的蛋白，细胞用量可适当降低，但最少不建议少于1e7/样本。

蛋白表达量可以参考https://www.proteomicsdb.org/

3、IP-MS推荐利用定量的方式进行备选互作蛋白的筛选，所以要求对照组的细胞、试剂用量和实验组保持一致。

4、市场上标注可用于IP的抗体，实际使用效果合格的仅占少部分。为节省时间和经费，推荐在实验关键节点进行质控。我们建议在目的蛋白的初次IP实验后，进行WB和考染/银染染色质控是必不可少的。

5、更多关于IP-MS的实验设计、实验材料、数据分析的介绍请关注公众号，接收后续更新。

6、本实验步骤为IP实验通用方法，各实验室应根据目的蛋白和抗体情况适当调整。其他亲和方式pull down仅可参考部分步骤。