微生物监测在器械消毒中的应用

微生物监测的医疗器械在清洁、消毒和灭菌

摘要

可重复使用的半关键性器械在当前医疗实践中已广泛用于诊断和治疗目的。然而，这些器械的重复使用存在微生物从一名患者传播给另一名患者的交叉传播风险。这些器械的清洁和消毒过程复杂、耗时、成本高，且极易出现操作失误。本文分析了与可重复使用半关键性器械相关的感染的流行病学特征，以及微生物学实验室通过微生物学检测在监测其清洁和消毒过程中的作用。文章还回顾了不同科学学会关于开展此类检测的相关建议，并制定了针对样本采集与处理、结果解释以及根据检测结果应采取措施的具体建议。

引言

在目前的医疗实践中，使用了大量用于诊断和治疗目的的医疗器械。在某些情况下，这些器械可能成为传染性病原体传播给易感宿主的媒介，从而导致医院感染或与医疗保健相关的感染。并非所有医疗器械在感染风险方面表现相同，因为这取决于其设计用途。

根据斯波尔丁分类法5，被归类为中危的可重复使用器械通常与医疗保健相关感染的发生最为密切。该类别通常包括软式内窥镜，定义为通过自然开口进入人体内部的器械（如胃镜、结肠镜、纤维支气管镜和膀胱镜）、气管插管、喉镜和直肠温度计。

对于这些器械的重复使用，必须在每位患者使用后进行高水平消毒过程。在许多情况下，这一过程十分复杂，不仅因为器械本身的结构复杂（如细长的管腔、阀门等），还因为该过程本身步骤繁琐，包括机械清洗、漏气管理、使用酶清洁剂清洗、冲洗、消毒、干燥和储存等环节，且高度依赖负责器械再处理的医务人员是否经过适当培训。这意味着该过程存在无法始终正确执行的风险。在此情况下，定期进行微生物学监测可作为质量指标，确保清洗和消毒过程的各个步骤均得到正确执行。

非关键性物品通常不会对患者构成感染风险，因此不需要进行微生物学监测。然而，有时在疫情暴发的背景下，可能需要对这些设备进行采样，以确定污染源和/或查明是否存在被污染的媒介物，这些媒介物可能是特定微生物传播链中的潜在环节。这种情况的一个例子是最近报道的与使用冷热设备调节心脏手术中体外循环时血液和心脏停搏液温度相关的嗜吞噬细胞分枝杆菌国际疫情暴发。为此，欧洲疾病预防和控制中心已发布了一份关于在这些设备及环境中实验室检测嗜鸟分枝杆菌的技术文件。

临床考虑

在使用任何中危器械的诊断或治疗操作后检测到并与该操作相关的感染，称为与该操作相关的感染。在某些情况下，感染是由于将微生物从患者体内一处拖带或转移至另一处所引起的，属于该操作本身的并发症（内源性感染源）。在其他情况下，受污染的器械作为微生物传播的载体（外源性感染源）。

关于此类设备使用过程中病原体传播发生率的高质量前瞻性研究较少。文献记录的大多数病例中，这种传播都与清洗和消毒过程中的至少一个步骤存在缺陷有关。这不仅凸显了这些操作未被正确执行的高频率，也反映了对此类操作的监测有限1,4,6，更令人担忧的是，尽管严格按照建议进行处理，其中一些器械仍出现持续定植现象13。

大多数已发表的病例都是在疫情爆发或由不常见或多重耐药微生物引起的假性疫情爆发背景下发现的，这些微生物由于在许多情况下都处于监测之中而易于被发现。6,13,14问题可能被低估了，与其他更常见的微生物发生交叉污染的情况可能未被察觉。2–4,7,8总体而言，在医学文献中，最常与通过这些设备传播相关的微生物是多重耐药革兰阴性杆菌（大肠杆菌coli，克雷伯氏菌肺炎克雷伯菌，假单胞菌铜绿假单胞菌，沙雷氏菌粘质沙雷氏菌，等）分枝杆菌和乙型B和C病毒2,4,6。

临床综合征

在许多情况下，微生物从一名患者交叉传播给另一名患者并不会导致临床感染的发生；相反，会发生无症状宿主定植。在发生有症状感染的情况下，其体征和症状表现多样。使用膀胱镜时，倾向于发生尿路感染，这些感染可能伴有或不伴有菌血症。使用胃肠道内窥镜时，可能出现菌血症、胆管炎、胆囊炎或肝炎。最后，使用纤维支气管镜和通气设备时，可能引发肺炎或菌血症。

致病性机制

微生物交叉传播的机制是通过器械污染实现的。这种污染可能源于先前接受过操作的患者的微生物群，也可能来自非生物环境（如灌洗液、自动清洗设备等）。此类器械中的污染可能由于多种原因持续存在：设备清洁/消毒过程中的操作失误、生物膜的形成，或设备存在结构异常（泄漏），即使正确执行了清洁程序，也难以彻底清除细菌。

微生物控制的作用

对可重复使用的中危器械进行微生物学监测是检测清洗和消毒过程中存在的缺陷以及器械表面异常（可能导致微生物持续存在）的工具。目前对于是否需要进行监测以及应采用何种方法尚无统一共识。然而，不同的科学协会建议将定期培养作为消毒过程质量控制的一部分，并就采样、样本处理及结果解释提供了指导。关于培养频率也尚未达成一致意见。不同的指南建议每月、每季度或每年进行一次培养。

采集用于微生物培养的样本

采样需要使用无菌设备（手套、注射器、刷子和容器）。样本必须始终在最大程度的无菌操作条件下采集。理想的采样时间是在消毒和储存过程之后，以评估该过程中是否发生了污染。

内窥镜管路

使用无菌注射器，将10–20毫升无菌生理盐水（0.9% NaCl）或无菌蒸馏水分别注入每条管路，并从内窥镜远端部分收集到无菌容器中。样本采集可包括将无菌刷插入管路，刷洗内部，然后将其与10毫升无菌生理盐水（0.9% NaCl）或无菌蒸馏水在无菌容器中混合。

内窥镜外表面

使用浸有无菌生理盐水（0.9% NaCl）的无菌拭子擦拭内窥镜的不同外表面（远端、管道开口点和抬钳器桥部）。每个拭子收集至含有胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的无菌容器中。

连接内窥镜的水瓶

通过常规方式使用无菌注射器采集2份100毫升的水样本。

自动清洗消毒器

2样本的100毫升的最终冲洗水应被收集在一个无菌容器（UNE EN-ISO 15883标准）。

终末冲洗水

若未使用自动清洗消毒机，应使用无菌注射器采集2份100毫升的水样本。

运输和储存的样本

样本必须置于密封的无菌容器中运送，并贴上标签以标明采样点以及内窥镜或清洗消毒机的编号。应立即处理，以防止潜在的细菌过度生长影响定量培养中的计数。如果需要延迟处理，则样本必须在2–5°C冷藏保存，且不得超过24小时。在某些情况下，根据所使用的消毒产品，可添加中和剂以去除可能残留的化学试剂，这些化学试剂可能会限制微生物的检出。

处理和加工的样本

不同的国家和国际组织已确定，对各类内窥镜（胃肠道内窥镜、膀胱镜和纤维支气管镜）进行微生物培养的目标应是检测口腔和肠道微生物群中的微生物。表1详细描述了可作为清洗和消毒过程不合格指示物的微生物。不建议尝试检测病毒，因为检测具有感染能力的完整病毒是一个复杂且高成本的过程。

通常，无需对所有分离的微生物进行药敏试验；但在某些情况下（如疑似疫情爆发或反复分离出肠杆菌或铜绿假单胞菌），药敏试验有助于检测多重耐药菌。

选择的培养基和样品培养条件

从内窥镜管路采集的样本 ：通常包括混合或汇集通过冲洗和刷洗内窥镜不同管路所收集的所有样本，并将它们作为一个整体处理。然而，如果某个内窥镜的微生物培养反复呈阳性，则可能需要对不同管路的样本分别进行处理。

推荐的培养基为：
- 需氧微生物 ：血琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂、Reasoner’s 2A‐琼脂和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。
- 分枝杆菌 ：7H10琼脂。

样本处理可采用两种方法：
- 直接接种 ：将1毫升样本接种于血琼脂或胰蛋白酶大豆琼脂平板中。
- 通过离心或过滤进行浓缩 ：
- 离心：在3000 rpm下进行15分钟，倾去上清液，将沉淀物重悬，并取0.1毫升接种于血琼脂中。
- 过滤：收集10毫升样本并通过孔径不超过0.45 μm的滤膜过滤，将滤膜置于胰蛋白酶大豆琼脂中培养。

两种技术中，平板可在30°C或37°C下培养48小时或7天（48小时时检查）。对于分枝杆菌培养，平板在37°C下培养21天。

从内窥镜外表面获取的样本 ：将拭子在10毫升胰蛋白胨大豆肉汤中搅拌，再用涡旋振荡器震荡，于37°C培养48小时。在48小时时，在选择性培养基上进行转种培养。

自动清洗机的冲洗水和连接内窥镜的瓶子中的水 ：取100–200毫升样品，使用孔径不超过0.45 μm的过滤器进行过滤，并将滤膜在血琼脂或Reasoner’s 2A‐琼脂上于30°C培养3–5天，或于37°C培养2天。若无可用过滤器，可将100毫升冲洗水加入100毫升TSB中，于37°C培养48小时，然后接种于选择性培养基进行传代培养；但该方法尚未经过验证。对于分枝杆菌培养，应使用Middlebrook 7H10琼脂等专用培养基，并于37°C培养21天。

结果解释标准

表1列出了需检测的微生物种类及应考虑的最低菌落形成单位数用于评估。

Cut-off点	微生物	频率	指南
<10 CFU/器械	低风险微生物群（皮肤和环境）：凝固酶阴性葡萄球菌、类白喉杆菌、微球菌spp.、芽孢杆菌spp.	未建立（除在十二指肠镜：每60程序或每月）	CDC
任何计数	高风险微生物群：S. aureus、Enterococcus spp.、S. viridans、P. aeruginosa、肠杆菌	相同截断值点如ESGENA和GESA	SEIMC 2012, UNE-ISO 15883
无生长	Enterococcus spp.、肠杆菌、S. viridans、NF GNB、分枝杆菌（支气管镜）	每月（十二指肠镜、支气管内窥镜），其他可弯曲内窥镜每季度，其他胃肠道内窥镜每年	GESA 2010
<20 CFU/通道	指示剂微生物：肠杆菌、P. aeruginosa、S. aureus	每季度或更频繁	ESGE-ESGENA 2007

注：CDC：疾病控制与预防中心；CFUs：菌落形成单位；ESGE-ESGENA：欧洲胃肠病内镜学会-欧洲胃肠病和内镜护士协会；GESA：澳大利亚胃肠病学会；NF GNB：非发酵革兰氏阴性杆菌；SEIMC：西班牙传染病和临床微生物学会

表2描述了培养结果的一般解释及根据这些结果建议采取的措施。

微生物分离	解释/措施
低菌落计数中的S. epidermidis生长	怀疑污染发生在采样或样品处理或储存过程中，建议重复采样
多台设备上检出显著数量的微生物	疑似清洁/消毒过程中的失败情况，建议对该流程进行审查，清洁和消毒程序应予以复查，采样应重新进行
分离出P. aeruginosa	疑似清洁/消毒过程中的失败情况，建议对该流程进行审查
分离出P. aeruginosa以及其他非发酵GNB	疑似干燥或储存过程中的器械出现污染或清洗用水受到污染，评估滤器安装位置的适宜性
反复生长出显著数量的某微生物在单一设备	设备存在疑似结构问题，建议制造商检查设备，并处理任何泄漏

报告结果

应联系并通知相关部门，并向医疗机构负责预防和管理感染的团队提交报告。此外，根据检测到的微生物及其接种量，必须建议采取适当措施（重新采样、器械审查以及清洁和消毒程序审查）。

任何受污染材料在微生物学监测结果合格之前均应停止使用。若分离出铜绿假单胞菌、其他非发酵革兰氏阴性杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等微生物，必须对暴露患者进行针对性随访。若从支气管镜样本中分离出结核分枝杆菌或脓肿分枝杆菌，也需进行此类随访。近年来，已报告因使用体外循环期间的冷热系统而引发的嗜鸟分枝杆菌导致侵入性心血管疾病的病例。

微生物学实验室应准备一份书面声明，内容包括培养结果以及向感染/患者安全委员会提交的关于该事件、已采取措施和问题解决情况的报告。

其他程序以检测有机废物

微生物培养作为监测中危器械消毒过程的一种工具，其主要缺点之一是获得结果所需时间较长。因此，已开发出可快速检测有机废物的其他技术。目前可用的技术包括三磷酸腺苷以及蛋白质、血红蛋白和碳水化合物残留物的检测。

三磷酸腺苷（ATP） 是一种良好的指标，可用于评估有机废物的存在，因为该分子存在于所有活细胞中。其存在通过生物发光进行检测，该过程利用荧光素酶（一种依赖ATP的酶）和荧光素（一种能产生光信号的蛋白质），并通过光度计以相对光单位测量所产生的光信号。由于ATP含量与发光量之间存在线性关系，因此有机废物越多，ATP含量越高，产生的光也越多。该技术可用于实时检测内窥镜表面和管腔的污染情况。大多数已发表的研究均采用此方法评估手工清洗过程在消毒前的有效性。手工清洗后若生物发光值较高，表明残留过多的有机废物，将影响消毒过程的有效性。设定的参考标准为200相对光单位，低于该值时，可认为内窥镜的管腔和表面在手工清洗后达到可接受水平。

市面上有多种商业试剂盒可用于检测蛋白质、血红蛋白和碳水化合物。这些试剂盒基于易于操作的比色反应，能够快速提供结果。在适当清洁后、消毒前的可接受临界值分别为：蛋白质<6.4 mg/cm²，碳水化合物<1.2 mg/cm²，血红蛋白<2.2 mg/cm²。

目前，无指南推荐使用这些生物标志物而非微生物培养。