29、酶活性测定与可逆抑制剂研究

酶活性测定与可逆抑制剂研究

酶活性测定中的稳定性问题

在酶活性测定过程中，酶活性的丧失是一个常见的问题。导致酶活性丧失的原因主要有以下几种：
- 溶液条件影响 ：适当的浓度以及对其他溶液条件进行微调，有助于改善酶的活性状况，延长活性酶在测定过程中的寿命。对于多底物酶，预先形成酶 - 底物二元复合物，再加入第二种底物启动反应，有时能显著增强酶的稳定性。
- 催化周转导致的自发失活 ：某些酶在催化周转过程中，相关化学反应可能通过形成共价加合物、破坏关键活性位点氨基酸残基或辅因子等方式使酶失活。例如，一些氧化还原酶在催化过程中会产生高破坏性的自由基，这些自由基积累后会攻击酶的活性位点，导致酶失活。为了减少自由基导致的失活，可以在反应混合物中加入自由基清除剂（如苯酚），或者加入少量过氧化物酶（如过氧化氢酶），但需要确保这些添加物不会以其他方式影响酶活性的测量。

为了诊断酶在活性测定过程中是否失活，可以进行以下两个简单的测试：
- 额外酶添加测试 ：让反应进程曲线提前达到平台期，然后加入少量额外的酶储备液，使反应混合物中的最终酶浓度加倍。如果酶失活是导致提前达到平台期的原因，那么加入新鲜酶后应该会出现第二阶段的反应。
- Selwyn’s 测试 ：在几种不同的酶浓度下测量反应进程曲线。该测试基于这样一个事实，即在其他条件恒定的情况下，积分速率方程具有一般形式：[ [E]t = f([P]) ]，其中 ([E]) 指溶液中活性酶分子的浓度，([P]) 是产物浓度。如果酶在测定过程中稳定，以 ([P]) 对 ([E]t) 作