36、慢结合酶抑制剂的研究进展与应用

慢结合酶抑制剂的研究进展与应用

1. 酶抑制可逆性的判断

在酶抑制研究中，判断抑制剂与酶的结合是否可逆至关重要。当对受抑制的酶进行透析时，若抑制剂与酶可逆结合，透析后酶活性应接近未抑制时的初始活性。但如果解离常数 (k_{off}) 极低，可能需要数小时甚至数天才能建立游离抑制剂和结合抑制剂之间的新平衡。不过，只要 (k_{off}) 不为零，抑制作用最终会逆转。当然，在这些操作过程中，必须确保酶本身的稳定性，否则难以区分是抑制剂导致的残余抑制还是蛋白质变性引起的酶失活。

为了区分共价失活和非共价抑制，可以通过使酶样品变性来观察原始抑制剂分子的释放情况。如果抑制剂是酶的共价亲和标记物，酶变性后，抑制剂会因共价键与变性蛋白结合在一起；若为非共价结合，酶变性时抑制剂则会释放到溶液中。

以研究前列腺素 (G/H) 合酶（PGHS2）的抑制剂 DuP697 为例，对受抑制的酶进行广泛透析后，酶活性并未恢复，这表明抑制剂可能与酶共价结合，或者 (k_{off}) 值极小。为确定其作用方式，研究人员进行了如下操作：
1. 用亚化学计量浓度的抑制剂处理微摩尔级的酶溶液，并让溶液长时间平衡。
2. 加入 4 倍体积的 1:1 甲醇/乙腈混合物使酶变性并沉淀。
3. 将变性蛋白溶液通过 30 kDa 截留滤器离心，滤液在氮气下干燥后，用少量二甲基亚砜或乙腈重新溶解。
4. 通过反相高效液相色谱（HPLC）测定释放的 DuP697 量，并测量重新溶解的滤液对新鲜酶样品的抑制能力。

结果发现，97% 添加到初始酶样品中的 DuP697 被回收，由此得出 DuP697 不是酶的共价修饰剂，而是符合特定模型且 (k_{off}) 值极小的结论。