iTSA与LiP-MS：药物靶点筛选的双子星

更多详情请见：LiP-MS药物靶点筛选技术 

在药物研发的复杂过程中，药物靶点的筛选是关键环节之一。化学蛋白质组学技术的出现，为药物靶点筛选提供了强大的工具。作为蛋白质组学的分支之一，化学蛋白质组学旨在深入了解蛋白质在生物体内的作用机制，为疾病诊断、治疗和药物研发提供重要信息。在这一领域，等温热迁移实验（Isothermal Shift Assay, iTSA）和LiP-MS（Limited Proteolysis Mass Spectrometry）技术犹如两颗璀璨的明星，照亮了药物靶点筛选的路径。这两种技术虽然各有特色，但都致力于揭示小分子药物与蛋白质之间的相互作用，以及这些相互作用如何影响蛋白质的结构和功能。在本文中，我们将深入探讨iTSA和LiP-MS技术的关系与区别，以及它们在现代药物研发中的重要应用。

一、等温热迁移实验

iTSA技术的核心原理在于捕捉蛋白质热稳定性的微妙变化。当小分子药物与靶蛋白发生结合时，会显著改变蛋白质的热稳定性，进而导致其在特定温度下的热变性曲线产生相应的改变。与热蛋白组学（TPP）技术不同，iTSA技术独具特色之处在于，它仅针对目的蛋白选定一种最适温度条件进行检测，以精准评估蛋白质的稳定性。通过细致监测蛋白丰度的变化，那些丰度显著变化的蛋白，便可被识别为与药物直接相互作用的蛋白，从而找到药物结合的靶蛋白，为药物作用机制的研究提供关键线索。

iTSA流程图

实验流程：

1.细胞处理：细胞样本与药物孵育后，在特定温度下进行热处理。

2.蛋白质提取：通过质谱分析上清中的蛋白，比较药物处理组和对照组的数据。

3.数据分析：丰度显著变化的蛋白即为药物直接相互作用的蛋白。

优势：

• 高通量：能够在全蛋白质组水平上进行筛选。
• 灵敏度高：能够检测到微弱的蛋白质-小分子相互作用。

局限性：

• 特异性较低：可能需要后续验证实验来确认靶点。

二、LiP-MS

LiP-MS技术基于有限蛋白水解的原理。小分子药物与蛋白质结合后，会引起蛋白质构象的变化，这种构象变化会影响蛋白酶的切割位点可及性，从而在有限的蛋白酶解过程中产生靶蛋白的特异性片段。通过比较代谢物处理样品与未处理样品中肽段的丰度差异，可以精确识别出与小分子药物结合的蛋白质及其作用位点。

LiP-MS流程图

实验流程：

• 细胞裂解：将细胞裂解以获得蛋白质样本。
• 小分子药物与裂解物的孵育：将小分子药物与细胞裂解物共同孵育。
• 有限蛋白酶切：在孵育后的裂解混合物中加入非特异性蛋白酶（如蛋白酶K）进行有限蛋白酶切。
• 胰蛋白酶消化：使用胰蛋白酶对蛋白质片段进行进一步消化，生成适合定量质谱分析的肽段。
• 质谱分析：通过LC-MS/MS分析检测肽段的质量和丰度。

优势：

• 高分辨率：能够精确检测小分子与蛋白质的结合位点。
• 适用样本类型广：适用于多种样本类型，包括蛋白质溶液、组织、细胞、细菌、酵母等。
• 同时检测蛋白质丰度和结构变化：为研究蛋白质-小分子相互作用提供了全面的视角。
• 揭示蛋白质在天然状态下的动态构象特征。

局限性：

• 靶蛋白具有较高的序列覆盖率。
• 蛋白质构象的动态变化可能掩盖或干扰结合位点的识别，影响结合位点的准确定位。

三、iTSA与LiP-MS技术的对比

技术方法	iTSA	LiP-MS
技术原理	基于热蛋白组学技术，通过在特定温度下进行热处理，检测蛋白质的热稳定性变化，从而揭示药物与蛋白质的相互作用。	通过小分子药物与蛋白质的结合引起蛋白质构象的变化，这种构象变化会影响蛋白酶的切割位点可及性，从而在有限的蛋白酶解过程中产生靶蛋白的特异性片段。
样品处理	细胞样本在药物处理后，在特定温度下进行热处理。	将细胞裂解以获得蛋白质样本，然后将小分子药物与细胞裂解物共同孵育。
检测方法	通过质谱分析上清中的蛋白，比较药物处理组和对照组的数据。	在孵育后的裂解混合物中加入非特异性蛋白酶（如蛋白酶K）进行有限蛋白酶切，然后使用胰蛋白酶对蛋白质片段进行进一步消化，生成适合定量质谱分析的肽段。
数据分析	丰度显著变化的蛋白即为药物直接相互作用的蛋白。	通过比较代谢物处理样品与未处理样品中肽段的丰度差异，可以精确识别出与小分子药物结合的蛋白质及其作用位点。
应用场景	主要用于药物靶点发现，通过检测蛋白质热稳定性的变化来鉴定药物的直接靶蛋白。	除了药物靶点发现外，还广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用、翻译后修饰研究、蛋白质折叠动力学研究等领域。

四、总结

在药物靶点筛选领域，等温热迁移实验（iTSA）和LiP-MS技术均为关键工具。iTSA通过监测蛋白质热稳定性的变化来锁定药物靶点，而LiP-MS则凭借对蛋白质构象变化的捕捉来实现靶点识别。二者在药物靶点筛选过程中各具千秋，具体选用哪项技术，需依据实际研究需求及实验条件综合考量。值得注意的是，当将iTSA与LiP-MS联合运用时，二者能够实现优势互补，提供更为全面、精准的药物靶点信息。这有助于深入剖析小分子药物与蛋白质之间错综复杂的作用机制，从而为药物研发进程注入强大动力，提供坚实的支撑。