28、酶活性的实验测定与稳定性研究

酶活性的实验测定与稳定性研究

1. 零势能与动力学同位素效应

在分子的电子态中，C - H 和 C - D 键的零点能存在差异。零点能（$E_0$）是指振动基态与势能阱最小值之间的能量差，它与振动频率（$\nu$）成正比，而振动频率又与参与振动的原子质量成反比。其相关公式为：
$\frac{1}{m}=\frac{1}{m_1}+\frac{1}{m_2}$

通过红外或拉曼光谱可测量 C - H 键伸缩振动的频率，典型值约为 2900 $cm^{-1}$，当用氘核取代质子形成 C - D 键时，振动频率会移至约 2200 $cm^{-1}$。这对应着 C - H 和 C - D 键的零点能分别为 4.16 和 3.01 kcal/mol，即 C - D 键的零点能比 C - H 键低 1.15 kcal/mol。

若反应物基态的所有振动势能都转化为过渡态的能量，那么 C - D 键的整体活化能会比 C - H 键增加 1.15 kcal/mol。活化能的增加会导致反应速率降低，这就解释了在动力学实验中观察到的重同位素反应速率降低的现象。

氘同位素取代对反应速率的影响通常用$V_{max}^{H}/V_{max}^{D}$或$k_{cat}^{H}/k_{cat}^{D}$的比值来表示。基于 C - H 和 C - D 键零点能的差异，若所有振动势能都转化为过渡能，这两个基团转移的活化能差异为 1.15 kcal/mol，根据相关公式可预计动力学同位素效应为：
$\frac{k_{C - H}^{cat}}{k_{C - D}^{cat}} = exp(-\frac{\Delta\Delta G^{\ddagger}}{RT}) = 7$ <