23、酶活性检测方法：荧光与放射性同位素测量技术解析

酶活性检测方法：荧光与放射性同位素测量技术解析

1. 荧光检测基础：斯托克斯位移与仪器设计

荧光检测在酶动力学研究中具有重要地位。斯托克斯位移是一个关键概念，它指的是分子的荧光发射最大波长总是比吸收最大波长长（能量更低）。例如，色氨酸在约 280 nm 处有最大吸收，而在 325 - 350 nm 之间有强烈荧光。

荧光仪器的设计利用了这一特性，通常用最大吸收波长的光激发比色皿中的样品，并在不同（更长）的波长处检测发射光。为了最大程度减少激发光束的干扰，大多数商用荧光计设计为在与激发光束路径成 90°角的位置收集发射光。因此，荧光比色皿至少需要有两个相互成直角的光学窗口，大多数荧光比色皿的四个侧面都有抛光的光学表面。

2. 荧光法跟踪酶动力学的优势与策略

荧光法跟踪酶动力学的策略与吸收光谱法类似。许多酶底物 - 产物对具有天然荧光，可方便地跟踪其在溶液中的消耗或生成。若分子本身无天然荧光，通常可共价连接一个荧光基团，而不显著影响其与研究中的酶的相互作用。

荧光测量相对于吸收测量有两个关键优势：
- 荧光仪器灵敏度高，能检测到底物或产物浓度的微小变化。
- 许多荧光团具有较大的斯托克斯位移，荧光信号通常处于光谱的孤立区域，来自其他反应混合物成分的信号干扰极小。

3. 荧光信号与浓度的关系及标准曲线的制备

在有限的浓度范围内，荧光信号与溶液中荧光团的浓度呈线性关系。原则上，荧光信号与荧光团浓度的关系类似于比尔定律，只是消光系数被摩尔量子产率（Φ）取代。但在实践中，通过应用 Φ 的列表值来计算样品浓度很困难，这部分是由于仪器和测量的性质所致。

因此，要将荧光强