25、酶活性测定中的分离方法

酶活性测定中的分离方法

在酶活性测定中，准确分离和定量分析底物与产物是关键步骤。本文将详细介绍高效液相色谱（HPLC）和电泳这两种常用的分离方法及其在酶活性测定中的应用。

1. 高效液相色谱（HPLC）

1.1 基本原理与定量方法

HPLC 是一种强大的分离技术，分子在 HPLC 色谱图上的典型信号如图 7.17 所示。样品在时间为零时注入色谱柱，根据色谱柱和流动相的特性，在特征保留时间后洗脱。样品中分子的浓度可以通过峰下积分面积或峰高来定量。

为了构建校准曲线，研究人员会使用纯样品，测量不同浓度的二氢乳清酸（DHO）和乳清酸（OA）注入后的峰面积，以峰面积为纵坐标，注入的分析物质量为横坐标构建曲线。由于注入样品的体积已知，可轻松将质量单位转换为标准浓度单位。例如，Ittarat 等人（1992）发现，在 0 - 200 μM 的浓度范围内，DHO 和 OA 的峰面积与浓度呈线性关系。通过绘制 DHO 或 OA 浓度随反应时间的变化曲线，可确定反应的初始速度。

1.2 峰面积定量方法

现代 HPLC 仪器通常使用内置计算机程序进行峰面积积分。若缺乏计算机接口仪器，可采用以下两种手动方法：
- 测量峰高 ：用直尺连接目标峰两侧的基线，从峰顶点向基线连线作垂直直线，用尺子测量该垂直线的长度，记录为峰高。对每个标准样品重复此操作以构建校准曲线。
- 估算积分面积 ：再次连接基线点，峰的两侧和基线构成一个近似三角形区域，用剪刀小心剪下该区域的纸条，在分析天平上称重，其质量可作为相对峰面积的合理估计。

显然，