24、酶活性检测与分离方法详解

酶活性检测与分离方法详解

1. 放射性标记底物在酶动力学研究中的应用

在酶动力学研究中使用放射性标记底物时，通常会将标记底物与“冷”（即未标记）底物混合，以达到特定的总底物浓度，同时避免使用大量放射性物质。不过，准确量化底物样品中放射性标记分子的比例十分重要，这通常用样品的比放射性来表示。比放射性的单位是每质量或摩尔浓度的样品的放射性，常见单位有 dpm/μmol 和 μCi/mg。确定底物样品的比放射性后，就能轻松将酶促反应过程中的放射性测量值转换为速度单位。

1.1 示例计算

以二氢乳清酸脱氢酶将二氢乳清酸转化为乳清酸的反应为例：
- 准备了比放射性为 1000 cpm/nmol 的底物储备溶液，反应混合物中底物终浓度为 1 mM，总体积 100 μL。
- 加入酶启动反应，在 37°C 下孵育。每 10 分钟取出 10 μL 反应混合物，加入 10 μL 6 N HCl 使酶变性，终止反应。
- 将 20 μL 混合物点样到 TLC 板上，分离产物和底物。刮下产物斑点，用闪烁计数法测量放射性。
- 从 cpm 与时间的关系图中可知，斜率为 100 cpm/min。由于底物比放射性为 1000 cpm/nmol，该斜率可直接转换为产物生成速度 0.1 nmol/min。
- 每次点样到 TLC 板上的反应混合物体积为 10 μL（即 1 × 10⁻⁵ L），将速度转换为摩尔浓度单位，可得速度为 10 μM/min。

计算总结如下：
|步骤|公式|转换结果|
| ---- | ---- | ---- |
|斜率转换为产物生成速度|$\frac{斜率}{比放射性}=\frac{