LiP-MS技术的优势与局限性

更多详情请见：LiP-MS药物靶点筛选技术 

在新药的研发中，在细胞内找到它的靶点以及作用机制非常重要，传统的生物物理方法，如X射线晶体学或核磁共振，虽然能提供高分辨率的结构信息，但通常局限于纯化的、单一的蛋白质体系，难以应对复杂生物样品的全蛋白质组研究。而一些化学蛋白质组学方法，如基于活性的蛋白质分析（ABPP），则需要对研究的小分子进行化学修饰，这可能改变其原有活性或引入干扰，所以需要一种能够在接近生理条件下，无需化学修饰，即可在整个蛋白质组范围内高通量监测蛋白质结构变化的技术。正是在这样的需求驱动下，LiP-MS技术应运而生，为新药研发和生命科学研究带来了曙光。

一、LiP-MS的原理

LiP-MS的核心思想是：蛋白质的特定三维结构决定了其表面哪些区域更容易被蛋白酶接近并切割。当蛋白质与小分子（如药物）结合，或发生翻译后修饰，或与其他蛋白质相互作用时，其局部构象会发生改变，这种改变会影响蛋白酶进入和切割位点。

具体来说，在天然构象下先使用一种广谱性蛋白酶（如蛋白酶K）对蛋白质样品进行短暂、有限的酶解，这种酶倾向于切割蛋白质表面暴露的、柔性的区域。如果药物结合导致某个区域变得更稳定或被遮蔽，那么该区域的酶切就会减少；反之，如果某个区域变得更暴露，酶切则会增加。随后，蛋白质被变性，并用另一种特异性蛋白酶（通常是胰蛋白酶）进行完全酶解。通过质谱分析，比较不同处理条件下产生的肽段的丰度变化，就能推断出蛋白质构象的变化位点。

二、LiP-MS的步骤

1、样品准备与处理：首先，准备好实验组（如药物处理）和对照组（如溶剂处理）的细胞、组织或生物体液等复杂生物样品。

2、有限蛋白酶解（LiP）：在非变性条件下提取蛋白质，然后加入广谱蛋白酶进行短暂孵育。酶的用量和孵育时间需要精确控制 。

3、变性与完全酶解：终止有限酶解反应，使蛋白质变性，然后加入胰蛋白酶进行彻底的二次酶解，产生适合质谱分析的肽段混合物 。

4、质谱检测：利用高效液相色谱-串联质谱对肽段进行分离和检测。可以根据需求选择数据依赖采集、数据非依赖采集或靶向模式等 。

5、数据分析：这是揭示奥秘的关键一步。通过比较实验组和对照组中特定肽段的信号强度差异，识别出发生结构变化的蛋白质及其区域。通常还需要设立仅用胰蛋白酶处理的对照组，以区分蛋白质丰度变化和结构变化带来的信号差异。

三、LiP-MS的优势性

LiP-MS技术之所以能在短时间内崭露头角，并被广泛应用于药物靶点发现、疾病生物标志物筛选等领域，得益于其诸多独特优势：

1、无需化学修饰：它直接在天然或近天然状态下研究蛋白质与小分子的相互作用，避免了化学标记可能带来的活性改变或空间位阻问题，保证了结果的真实性。

2、结构与丰度信息兼得：通过巧妙的实验设计，LiP-MS不仅能揭示蛋白质的结构变化，还能同时监测蛋白质的丰度变化，提供更全面的生物学信息。

3、普适性强：该技术适用于多种复杂生物样本，如细胞裂解液、组织提取物、血液甚至完整的细菌或酵母细胞，真正实现了在“原位”探测蛋白质结构变化。

4、高通量与系统性：LiP-MS能够同时分析数千种蛋白质的结构变化，实现对整个蛋白质组的系统性扫描，这对于发现未知的药物靶点或理解复杂的生物学过程至关重要。

5、定位相互作用位点：它不仅能告诉你哪个蛋白质发生了变化，还能精确到蛋白质的哪个区域（肽段）参与了相互作用或构象改变，为后续的功能研究和药物设计提供关键线索。

四、LiP-MS的局限性

尽管LiP-MS技术功能强大，但它也存在一些局限性和需要克服的挑战：

1、对微小变化的敏感度：如果小分子结合引起的蛋白质构象变化非常微小，或者不显著影响蛋白酶的切割位点，LiP-MS可能难以检测到这些细微的信号。

2、低丰度蛋白质的挑战：对于细胞内含量极低的蛋白质，其产生的肽段信号可能被高丰度蛋白质的信号所掩盖，检测难度较大，尽管DIA等技术正在努力改善这一点。

3、数据分析的复杂性：LiP-MS产生的数据量庞大，如何从中准确区分真实的结构变化信号与背景噪音，如何有效整合蛋白质丰度变化进行校正，都需要复杂的生物信息学算法和专业的分析流程。

4、酶切位点的覆盖度：虽然广谱性蛋白酶能产生较多切割位点，但仍可能存在某些蛋白质区域缺乏合适的酶切位点，导致这些区域的结构变化无法被有效监测。

5、动态范围与定量准确性：虽然可以进行定量，但在极大的动态范围内精确量化微小的结构变化，并确保实验的可重复性，仍是持续优化的方向。

五、总结

LiP-MS技术无疑是结构蛋白质组学领域的一项重大突破，让我们能够以前所未有的深度和广度，在复杂的生命体系中直接观察蛋白质的动态结构变化。从最初概念的提出到如今在药物发现、疾病机制解析和新型生物标志物开发等多个前沿领域的广泛应用，LiP-MS已经证明了其巨大的潜力。

随着质谱仪灵敏度和分辨率的不断提升、数据分析算法的持续优化以及与其他组学技术的融合，我们有理由相信，LiP-MS技术将不断完善，为我们揭示更多生命的奥秘，并在精准医疗和新药研发的征途上扮演越来越重要的角色。