零基础小白笔记7 | 对bam文件进行去重和过滤

  ❀前言：（书接上回）

零基础小白笔记1 | ChIP-seq原理、操作流程、分析流程

零基础小白笔记2 | 数据与样本信息处理

零基础小白笔记3 | 数据处理与质控

零基础小白笔记4 | 数据质控报告全解读

零基础小白笔记5 | 数据清洗与再次质控

零基础小白笔记6 | 使用bowtie2进行数据比对

一、为何要进行去重：

    我们在建库时通常会进行PCR操作。在这个过程中，来自一个DNA片段的两个拷贝可能会锚定在两个reads上，这两条reads都会进行测序。在PCR扩增次数过多的情况下，会导致一些序列持续扩增，而另一些序列扩增到一定程度后便不会再进行，此时便会出现扩增偏差影响置信度。

    一般认为若有两条reads比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的reads是由PCR扩增而来，就会被标记。

二、使用picard去除重复：

1.picard：是一个用于处理和分析生物信息学数据的工具集，主要用于处理与测序数据相关的任务。通过 Picard 工具，可以识别和标记 PCR 重复，这对于测序数据的后续分析是很重要的。

2.使用用法：

picard MarkDuplicates \                     
-INPUT /your/input/file_sort.bam \
-OUTPUT /your/output/file_sort_picard.bam \
-METRICS_FILE /your/info/file_sort_picard.mat \
-REMOVE_DUPLICATES true

（2.1）markduplicates：是 Picard 工具集中的一个命令行工具，主要用于识别和标记测序数据中的 PCR 重复。使用此工具可以帮助研究人员去除PCR重复；

• -INPUT：表示输入的bam文件；
• -OUTPUT：表示标记 PCR 重复后的输出文件；
• -METRICS_FILE：生成的 PCR 重复统计信息文件；
• -REMOVE_DUPLICATES：true表示默认移除PCR重复的reads；

三、使用samtools工具过滤

samtools view -hb -q 10 -F 4 -@ 6 /your/input/file.bam > /your/output/file_filter.bam

1.samtools view 是 Samtools 工具包中的一个命令，用于查看和转换 SAM/BAM 格式的文件，也可用于过滤掉质量比较低的序列；

2. 用法：samtools view  [options]  <in.bam>|<in.sam>|<in.cram> 

• -b，--bam：输出以 BAM 格式显示。如果输入文件已经是 BAM 格式，则该选项无效；
• -h，--header：显示文件头信息；
• -F，--exclude：排除指定的标志位；-F 4 表示删除未配对的reads；
• -f：表示保留指定标志位；
• -q：仅显示比对质量大于等于指定阈值的比对；-q 10表示显示对比适量大于10的reads；
• -@ ：表示使用的线程数；
• >：为重定向符；表示输出文件到指定目录；

四、为bam文件创建目录

samtools index -@ 6 -b /your/input/file_filter.bam

1.samtools index是 Samtools 工具包中的一个命令，用于为 BAM 文件创建索引，以便于快速的随机访问。本操作主要为方便后续操作而创建关于bam文件的目录；将生成一个名为input.bam.bai的索引文件。

2.使用用法：samtools index [-bc] [-m INT]  <in.bam> 

• -b：表示为bam文件建立一个bai格式的索引；
• -@：使用的线程数；