BCKDK 调控肾小管细胞中亮氨酸介导的代谢重编程

已有研究发现，DKD 体内亮氨酸水平升高与糖尿病向 ESRD 进展相关，且亮氨酸作为必需氨基酸，其循环水平由饮食摄入与蛋白合成、分解代谢的平衡决定，经肾小球自由滤过后主要由近端肾小管重吸收。在健康组织中，亮氨酸可快速氧化进入三羧酸循环（TCA 循环），肾脏是其氧化代谢的主要场所之一。亮氨酸降解过程中，支链 α- 酮酸脱羧酶 E1α（BCKDHA）和中链酰基辅酶 A 脱氢酶（ACADM）是关键催化酶，而支链酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）可通过磷酸化 BCKDHA 抑制这一限速步骤。

此外，亮氨酸能作为分子信号激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，该通路参与调控肾小管细胞代谢及肾间质纤维化，且在多囊肾中已证实亮氨酸通过激活 mTOR 加速疾病进展。但截至目前，DKD 进展过程中肾小管亮氨酸代谢的调控机制及病理意义尚未明确，BCKDK 介导的亮氨酸代谢异常是否参与 DKD 进展仍有待探究。

动物实验采用两种糖尿病模型：BKS-db/db 小鼠（瘦素受体突变型）及链脲佐菌素（STZ）诱导的 C57Bl6J 小鼠。STZ 模型通过单次静脉注射 120 mg/kg STZ 构建，以体重下降、多尿及血糖 > 16.7 mmol/l 为造模成功标准。构建肾小管特异性 BCKDK 敲除小鼠时，先利用 CRISPR/Cas9 技术构建 C57BL/6JGpt 背景的 Bckdk-floxed 小鼠，将其与 Slc34a1-CreERT2 小鼠杂交，子代互交后获得 Bckdkfl/fl;Slc34a1-CreERT2+/−小鼠（PT-BCKDK−/−），4 周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导基因敲除，以同窝 Bckdkfl/fl;Slc34a1-CreERT2−/−小鼠为野生型对照。

干预措施包括：12 周龄时通过尾静脉注射 1×10¹² 病毒颗粒的 AAV9-Ksp-shBCKDK（靶向小鼠 BCKDK 687~706 位点）；给予含 100%、33% 或 17% 标准亮氨酸含量的等能等氮饲料；腹腔注射 20 mg/kg 3,6 - 二氯苯并 [b] 噻吩 - 2 - 羧酸（BT2），每日一次，持续 4 周。检测指标包括血糖、尿白蛋白、尿肌酐、肾重 / 体重比，肾组织经固定后行 HE、PAS 及油红 O 染色，免疫组化检测 BCKDK、BCKDHA、ACADM 表达，Western blot 分析降解酶及 mTOR 通路蛋白水平。

细胞实验选用人胚肾 HEK293T 细胞及原代肾小管上皮细胞（PTECs）。PTECs 从 3 周龄小鼠肾脏分离，经胶原酶消化后通过 250 μm 和 80 μm 筛网获取近端小管片段，接种于胶原包被的滤膜支架，在含 5.5 mmol/l 葡萄糖、0.45 mmol/l 亮氨酸的培养基中培养至融合。采用 CRISPR/Cas9 技术构建 BCKDK-KO HEK293T 细胞，通过测序及蛋白水平验证敲除效率。

细胞处理条件包括：30 mmol/l 葡萄糖刺激（甘露醇为渗透压对照）、10 mmol/l 亮氨酸干预（不同时间或剂量梯度），以及联合抑制剂处理 ——2.5 nmol/l 雷帕霉素（AbMole #M1768）、200 μmol/l Torin 1（AbMole #M2276）、0.2 μmol/l JPH203（AbMole）或 25 μmol/l BT2。其中 JPH203 为 L 型氨基酸转运体 2（LAT2）抑制剂，用于阻断亮氨酸摄取。采用 Seahorse XF Pro 分析仪检测氧消耗率（OCR）及细胞外酸化率（ECAR），评估线粒体呼吸及糖酵解功能，油红 O 染色观察脂质积累，Western blot 检测相关蛋白磷酸化及表达水平。

转录组与代谢组分析中，从 GEO 数据库下载 GSE30529 数据集（10 例 DKD 及 12 例对照的肾小管基因表达数据），经 GEO2R 分析后，通过 DAVID 及 KOBAS 进行 GO 和 KEGG 富集分析。小鼠肾小管样本的转录组文库构建于 BGIseq500 平台，采用 limma 包筛选差异基因（log₂FC≥0.5 且 p<0.05）；代谢组通过 Q300 试剂盒检测，结合 iMAP 平台分析，以 VIP≥1 且 p<0.05 为差异代谢物标准。

研究首先明确 DKD 进展中肾小管亮氨酸降解存在缺陷。动物实验中，db/db 小鼠肾小管内亮氨酸及其中间代谢产物 α- 酮异己酸水平升高，12 周龄和 16 周龄时 p-BCKDHA（Ser293）和 BCKDK 蛋白水平较 db/m 小鼠显著增加，BCKDHA 和 ACADM 则降低，STZ 模型小鼠也呈现类似趋势。葡萄糖刺激的 PTECs 中，p-BCKDHA 和 BCKDK 表达上调，ACADM 表达下调，进一步证实高糖环境下肾小管亮氨酸降解功能受损。

增强亮氨酸降解可缓解高糖诱导的肾小管细胞代谢重编程。BCKDK-KO HEK293T 细胞中，高糖引起的 p-BCKDHA 升高及 ACADM 降低被完全逆转，线粒体呼吸功能（基础呼吸、ATP 生成、最大呼吸及备用呼吸容量）较野生型细胞显著恢复，糖酵解水平（ECAR）及脂质 droplet 积累减少。PTECs 经 BT2 处理后，同样观察到亮氨酸降解酶表达改善，线粒体呼吸抑制缓解，糖酵解及脂质积累减轻，且呈剂量依赖性。

动物实验中，肾小管特异性敲除 BCKDK 的 STZ 模型小鼠，肾小管内 p-BCKDHA 和 BCKDK 水平降低，ACADM 升高，尿 LeuCR 显著下降，尿白蛋白、肾重 / 体重比均低于野生型糖尿病小鼠，肾小球和肾小管肥大程度减轻，脂质积累减少，且未影响血糖及体重。AAV9 介导的 Bckdk 沉默在 db/db 和 STZ 模型中均能重现类似表型，BT2 干预也显著改善两种模型小鼠的肾脏病理指标及脂质代谢异常。

亮氨酸通过激活 mTOR 通路诱导肾小管细胞代谢重编程。PTECs 经亮氨酸处理后，p-mTOR（Ser2448）和 p-p70S6K（Thr389）水平呈剂量和时间依赖性升高，10 mmol/l 亮氨酸处理 30 min 即可达到峰值。雷帕霉素或 Torin 1（均为 mTOR 抑制剂）可显著阻断亮氨酸诱导的 mTOR 通路激活，同时恢复亮氨酸抑制的线粒体呼吸功能，降低糖酵解水平及脂质积累。采用 JPH203（AbMole）阻断亮氨酸摄取后，亮氨酸引起的 mTOR 通路激活、线粒体功能抑制、糖酵解增强及脂质积累均被逆转，LAT2 shRNA 转染实验也得到一致结果。BCKDK-KO HEK293T 细胞中，亮氨酸诱导的 mTOR 通路激活及代谢异常均消失，BT2 处理同样能抑制亮氨酸介导的 mTOR 激活及下游代谢改变，证实 BCKDK 通过调控亮氨酸水平影响 mTOR 通路活性。

低亮氨酸饮食可缓解糖尿病小鼠 DKD 进展。db/db 小鼠给予 33% 或 17% 亮氨酸含量的饲料 4 周后，尿 LeuCR 降低，肾脏组织中 mTOR 通路激活受抑，尿白蛋白、肾重 / 体重比显著下降，肾小球和肾小管肥大及脂质积累减轻，且对血糖和体重无影响。STZ 模型小鼠经低亮氨酸饮食干预后，也呈现类似的肾脏保护效应，进一步证实降低亮氨酸负荷可改善 DKD 病理进程。

综上，本研究证实 DKD 肾小管存在亮氨酸降解缺陷，BCKDK 表达升高通过抑制 BCKDHA 活性阻碍亮氨酸代谢，导致亮氨酸在肾小管内积累，进而激活 mTOR 通路诱导代谢重编程，表现为线粒体呼吸抑制、糖酵解增强及脂质积累，最终加速 DKD 进展。通过基因敲除或 BT2 抑制 BCKDK、JPH203（AbMole）阻断亮氨酸摄取或低亮氨酸饮食，均可通过调控亮氨酸 - mTOR 轴改善肾脏病理损伤。

此外，ULeuCR 可作为预测糖尿病肾功能快速下降的潜在标志物，为 DKD 的早期监测及靶点开发提供了新的实验依据。研究局限性在于未明确 DKD 接受不同干预后亮氨酸水平的动态变化，且 ULeuCR 的预测价值尚未经外部队列验证，这些问题需在后续研究中进一步探索。