CD36 介导的脂肪酸代谢重编程调控滑膜成纤维细胞功能

滑膜成纤维细胞（FLSs）作为滑膜组织的主要功能细胞，在维持滑膜稳态中发挥核心作用，其功能异常（如异常增殖、过度迁移侵袭及炎症因子大量分泌）是导致滑膜组织稳态失衡的关键环节。FLSs 一旦获得持续激活的表型，可表现出抗凋亡、逃避接触抑制、高侵袭性等特征，即使脱离原有微环境，这些异常表型仍能维持，进而推动滑膜组织的病理性改变。目前，针对 FLSs 功能调控的机制研究多聚焦于炎症信号通路，而代谢重编程作为细胞功能异常的重要分子基础，其在 FLSs 激活中的作用及调控机制尚未得到充分阐明，亟需进一步探究以挖掘新的调控靶点。

近年来，代谢重编程被证实是细胞功能异常的核心驱动因素之一，其中糖、脂、氨基酸代谢的紊乱不仅为细胞高增殖、高迁移提供能量与物质支持，还通过调控信号通路参与细胞功能表型的塑造。脂肪酸代谢作为细胞能量代谢的关键分支，其平衡（摄取、氧化 FAO 与合成的动态稳定）直接影响细胞的功能状态：脂肪酸氧化可为细胞提供大量 ATP，而脂肪酸合成则参与细胞膜构建及信号分子生成。CD36 作为 B 类清道夫受体家族的跨膜糖蛋白，既是细胞摄取游离脂肪酸（FFA）的关键转运体，也是维持细胞内脂肪酸稳态的核心调控因子，同时还参与炎症反应、信号转导等多种生理病理过程。

已有研究表明，CD36 在动脉粥样硬化、代谢综合征等代谢相关性疾病中，通过调控脂肪酸代谢及炎症反应影响细胞功能；在滑膜组织微环境中，CD36 也被发现与细胞代谢异常相关，但 CD36 如何通过介导脂肪酸代谢重编程调控 FLSs 的增殖、炎症、迁移侵袭等功能表型，以及该过程涉及的信号通路，目前仍缺乏系统研究。基于此，本研究围绕 CD36 在 FLSs 中的表达、对脂肪酸代谢的调控及对 FLSs 功能的影响展开，旨在揭示 CD36 介导的代谢重编程在 FLSs 功能调控中的作用机制，为滑膜稳态失衡的干预提供新的分子靶点。

细胞内脂滴检测采用两种方法：Bodipy 493/503 荧光染色及油红 O 染色。其中 Bodipy 493/503 荧光染料购自 AbMole BioScience（M9850），该染料具有亲脂性，可特异性结合细胞内中性脂滴，通过荧光强度直接反映脂滴含量，且荧光信号稳定、特异性高，是检测细胞内脂滴的常用工具。具体实验步骤为：将 FLSs 以 1.5×10⁴细胞 / 孔接种于 24 孔板，加入 500 μL 完全培养基，过夜培养使细胞贴壁；次日加入 150 μM 棕榈酸处理 24 小时以诱导脂滴积累，同时设置未处理对照组；处理结束后，用 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次，加入 4% 多聚甲醛固定 15 分钟；再次用 PBS 洗涤 2 次，加入 1 μM AbMole 的 Bodipy 493/503 染液，37℃避光孵育 30 分钟；孵育结束后，用 PBS 洗涤 3 次以去除未结合的染料，加入 1 μg/mL DAPI 染液避光孵育 5 分钟以染核；最后用 PBS 洗涤 3 次，在蔡司 880 双光子共聚焦激光扫描显微镜下观察并拍摄图像，激发波长设置为 488 nm，发射波长设置为 505-515 nm，使用 ImageJ 软件定量脂滴荧光强度，每组设置 3 个复孔，实验重复 3 次。油红 O 染色则使用细胞专用油红 O 染色试剂盒，按说明书操作：FLSs 处理及固定步骤同荧光染色，加入油红 O 染液室温孵育 10 分钟，PBS 洗涤 3 次，加入苏木素染液复染 5 分钟，自来水冲洗至细胞核呈蓝色；在倒置荧光显微镜下拍摄图像，使用 ImageJ 软件定量红色染色面积，反映脂滴相对含量，实验重复 3 次。

ROS 检测采用 DCFH-DA 荧光探针法：将 FLSs 以 2×10⁴细胞 / 孔接种于 24 孔板，过夜培养；加入 20 μM SSO 或相应对照处理 24 小时；处理结束后，用无血清 DMEM 洗涤细胞 2 次，加入 10 μM DCFH-DA（AbMole，M9096），37℃避光孵育 30 分钟；用无血清 DMEM 洗涤 3 次以去除未进入细胞的探针，在倒置荧光显微镜下拍摄图像，激发波长 488 nm，发射波长 525 nm；使用 ImageJ 软件定量荧光强度，反映细胞内 ROS 水平，每组设置 3 个复孔，实验重复 3 次。

线粒体膜电位（ΔΨm）检测采用 JC-1 试剂盒：JC-1 是一种阳离子荧光染料，可根据线粒体膜电位变化发生颜色转换 —— 当膜电位正常时，JC-1 聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出红色荧光；当膜电位去极化时，JC-1 以单体形式存在于细胞质中，发出绿色荧光，通过红绿荧光比值可反映线粒体膜电位水平。具体实验步骤为：FLSs 处理同 ROS 检测，加入 JC-1 工作液（按试剂盒说明书配制），37℃避光孵育 20 分钟；用 JC-1 染色缓冲液洗涤细胞 2 次；在倒置荧光显微镜下分别观察红色荧光（聚合体）和绿色荧光（单体），激发波长分别为 525 nm（绿色）和 590 nm（红色）；使用 ImageJ 软件定量红绿荧光强度，计算红绿荧光比值，比值降低提示线粒体膜电位去极化，实验重复 3 次。

所有实验数据采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析与图表绘制，数据以 “均值 ± 标准误（mean±SEM）” 表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用 Tukey 事后检验；两组间比较采用独立样本 t 检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义，所有实验均至少重复 3 次以确保结果的可靠性。

研究结果显示，CD36 敲低或 SSO 处理可显著诱导 FLSs 线粒体功能障碍，并重塑脂肪酸代谢表型。Western blot 及 qRT-PCR 验证结果显示，LV-CD36-RNAi 转染后，FLSs 中 CD36 的 mRNA 及蛋白表达水平较对照组显著降低（分别降低 62.3%±5.7%、58.9%±4.9%，P<0.01）；20 μM SSO 处理 24 小时后，CD36 蛋白表达水平也显著下调（降低 49.2%±6.1%，P<0.01），免疫荧光结果进一步证实，CD36 敲低及 SSO 处理组的 FLSs 中，CD36 的荧光信号强度较对照组显著降低（降低 51.5%±5.3%，P<0.01），表明 CD36 的敲低与抑制模型构建成功。RNA 测序分析显示，CD36 敲低后，FLSs 中与细胞增殖、迁移、凋亡、炎症反应及脂质代谢相关的基因表达发生显著改变，其中脂肪酸代谢相关通路（如 “脂肪酸降解”“脂肪酸合成” 通路）的富集最为明显（富集倍数分别为 2.8、2.5，P<0.001），提示 CD36 可能通过调控脂肪酸代谢影响 FLSs 功能。

透射电镜观察结果显示，对照组 FLSs 的线粒体形态规则，呈椭圆形或杆状，线粒体嵴清晰且排列整齐，无明显肿胀或空泡化；而 CD36 敲低及 SSO 处理组的 FLSs 线粒体出现明显形态异常，表现为线粒体显著肿胀（线粒体截面积较对照组增加 35.7%±4.2%、32.1%±3.8%，P<0.01）、嵴断裂甚至消失，部分线粒体出现空泡化改变，同时胞质中可见大量自噬体结构（自噬体数量较对照组增加 2.3 倍、2.1 倍，P<0.01），提示线粒体结构损伤可能触发了细胞自噬。ROS 检测结果显示，CD36 敲低及 SSO 处理组的 FLSs 内 ROS 荧光强度较对照组显著升高（分别升高 48.6%±5.2%、45.3%±4.7%，P<0.01）；线粒体膜电位检测显示，两组处理组的 JC-1 红绿荧光比值较对照组显著降低（分别降低 52.8%±5.6%、49.5%±5.1%，P<0.01），表明 CD36 表达降低可导致 FLSs 线粒体功能受损，表现为 ROS 生成增加及膜电位去极化。

采用 AbMole 的 Bodipy 493/503 荧光染料对 FLSs 内脂滴进行特异性染色，结果显示对照组 FLSs 胞质中可见大量明亮的绿色荧光颗粒（脂滴），而 CD36 敲低及 SSO 处理组的绿色荧光颗粒数量显著减少，荧光强度较对照组显著降低（分别降低 56.7%±6.3%、53.2%±5.8%，P<0.01）；油红 O 染色结果也显示，处理组的红色染色面积较对照组显著减少（分别降低 54.3%±5.9%、50.8%±6.2%，P<0.01）；细胞内 FFA 定量检测进一步证实，处理组的 FFA 含量较对照组显著降低（分别降低 47.9%±5.4%、45.6%±5.6%，P<0.01），上述结果一致表明 CD36 表达降低可显著减少 FLSs 内脂滴积累。Western blot 检测脂肪酸代谢关键蛋白表达显示，CD36 敲低及 SSO 处理组中，脂肪酸氧化关键限速酶 CPT1A 的蛋白表达水平较对照组显著升高（分别升高 68.4%±6.5%、63.2%±5.9%，P<0.01），而脂肪酸合成相关蛋白 FASN（分别降低 42.3%±5.1%、39.8%±4.8%，P<0.01）、ACC1（分别降低 38.7%±4.6%、36.5%±5.2%，P<0.01）、ACLY（分别降低 35.9%±4.9%、33.7%±4.5%，P<0.01）的表达水平显著降低，提示 CD36 可通过促进脂肪酸合成、抑制脂肪酸氧化维持 FLSs 的脂质稳态，而 CD36 的下调可诱导 FLSs 发生脂肪酸代谢重编程，使细胞代谢模式从脂肪酸合成为主转向脂肪酸氧化为主。

CD36 对 FLSs 炎症表型的调控作用通过炎症因子及基质金属蛋白酶（MMPs）的检测得到进一步验证。qRT-PCR 结果显示，CD36 敲低及 SSO 处理后，FLSs 中促炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 的 mRNA 表达水平较对照组显著降低（IL-1β：分别降低 58.6%±5.8%、53.2%±5.4%，P<0.01；IL-6：分别降低 55.3%±6.2%、50.1%±4.9%，P<0.01；TNF-α：分别降低 52.1%±5.5%、48.7%±5.3%，P<0.01），同时 MMP1、MMP9 的 mRNA 表达水平也显著下调（MMP1：分别降低 49.8%±4.7%、45.9%±4.8%，P<0.01；MMP9：分别降低 47.3%±5.1%、43.6%±5.2%，P<0.01）。Western blot 结果显示，炎症相关蛋白 MMP3（分别降低 46.8%±5.2%、43.9%±4.7%，P<0.01）、pro-IL-1β（分别降低 51.2%±5.6%、48.5%±5.3%，P<0.01）及炎症小体关键蛋白 NLRP3（分别降低 49.3%±5.1%、46.7%±4.9%，P<0.01）的表达水平也显著降低。ELISA 检测进一步证实，CD36 敲低及 SSO 处理组的 FLSs 培养上清中，IL-1β、IL-6 的分泌量较对照组显著减少（IL-1β：分别降低 53.6%±5.4%、49.8%±5.1%，P<0.01；IL-6：分别降低 50.2%±4.8%、47.1%±4.6%，P<0.01），上述结果表明 CD36 可通过调控炎症因子及 MMPs 的表达与分泌，促进 FLSs 的炎症表型，而抑制 CD36 表达可有效减弱 FLSs 的炎症反应。

在细胞增殖与凋亡方面，RNA 测序的基因集富集分析（GSEA）显示，CD36 敲低后 FLSs 中 “细胞周期” 信号通路显著富集（NES=-1.8，P<0.01），提示 CD36 敲低可能导致 FLSs 细胞周期阻滞。Western blot 检测细胞周期关键蛋白显示，CD36 敲低及 SSO 处理组中，细胞周期 G1/S 期转换关键调控蛋白 CDK4（分别降低 48.3%±5.2%、45.1%±4.9%，P<0.01）及 Cyclin D1（分别降低 52.6%±5.5%、49.3%±5.1%，P<0.01）的表达水平较对照组显著降低；CCK8 实验结果显示，两组处理组的细胞增殖 A 值较对照组显著降低（分别降低 38.7%±4.6%、35.2%±4.8%，P<0.01），表明 CD36 可通过调控细胞周期蛋白的表达，维持 FLSs 的高增殖能力，而 CD36 表达降低可抑制 FLSs 增殖。同时，Western blot 检测凋亡相关蛋白显示，CD36 敲低及 SSO 处理组中，促凋亡蛋白 Bax 的表达水平较对照组显著升高（分别升高 62.4%±6.3%、58.7%±5.9%，P<0.01），抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达水平显著降低（分别降低 47.8%±5.4%、45.3%±5.1%，P<0.01），导致 Bax/Bcl-2 比值显著升高（分别升高 2.1 倍、1.9 倍，P<0.01），提示 CD36 可通过抑制凋亡相关通路增强 FLSs 的抗凋亡能力，而 CD36 下调可促进 FLSs 凋亡。

细胞迁移与侵袭实验结果进一步揭示了 CD36 对 FLSs 运动能力的调控作用。划痕实验显示，培养 24 小时后，CD36 敲低及 SSO 处理组的 FLSs 划痕愈合率较对照组显著降低（分别降低 49.6%±5.3%、46.2%±5.1%，P<0.01），表明 CD36 表达降低可抑制 FLSs 的迁移能力。Transwell 迁移实验显示，处理组穿过小室膜的 FLSs 数量较对照组显著减少（分别降低 53.8%±5.7%、50.3%±5.4%，P<0.01）；Transwell 侵袭实验中，由于 Matrigel 模拟了细胞外基质环境，处理组穿过 Matrigel 及小室膜的细胞数较对照组减少更为明显（分别降低 58.2%±6.1%、54.7%±5.8%，P<0.01），提示 CD36 不仅影响 FLSs 的迁移能力，还对其侵袭能力具有调控作用。上皮 - 间充质转化（EMT）是细胞获得高迁移侵袭能力的重要机制，Western blot 检测 EMT 相关蛋白显示，CD36 敲低及 SSO 处理组中，间质标志物 N-cadherin 的表达水平较对照组显著降低（分别降低 51.7%±5.5%、48.9%±5.2%，P<0.01），而上皮标志物 E-cadherin 及另一间质标志物 Vimentin 的表达水平无明显变化（P>0.05），提示 CD36 可能通过调控 N-cadherin 的表达参与 FLSs 的 EMT 过程，进而影响其迁移侵袭能力。

为进一步探究 CD36 调控 FLSs 功能的分子机制，本研究对信号通路的变化进行了分析。RNA 测序的火山图及热图显示，CD36 敲低后 FLSs 中有 232 个差异表达基因（|log2FC|>1，P<0.05），其中能量代谢相关基因 PRKAA2（编码 AMPKα2 催化亚基）显著上调（log2FC=1.8，P<0.001）；KEGG 富集分析显示，差异基因主要富集于 AMPK、PI3K/AKT/mTOR、TGF-β 等与细胞代谢及功能调控相关的信号通路（富集倍数分别为 3.2、2.9、2.7，P<0.001），提示这些通路可能参与 CD36 介导的 FLSs 功能调控。Western blot 及 qRT-PCR 验证结果显示，CD36 敲低及 SSO 处理组中，PRKAA2 的 mRNA 表达水平较对照组显著升高（分别升高 72.4%±6.8%、68.3%±6.5%，P<0.01），同时 AMPKα2 的总蛋白及磷酸化蛋白（p-AMPKα2）水平均显著升高（p-AMPKα2/AMPKα2 比值分别升高 2.3 倍、2.1 倍，P<0.01），表明 CD36 表达降低可激活 AMPK 信号通路。相反，处理组中 PI3K、AKT、mTOR 的总蛋白及磷酸化蛋白（p-PI3K、p-AKT、p-mTOR）水平均显著降低（p-PI3K/PI3K 比值：分别降低 56.3%±5.9%、53.1%±5.6%，P<0.01；p-AKT/AKT 比值：分别降低 59.7%±6.2%、56.4%±5.8%，P<0.01；p-mTOR/mTOR 比值：分别降低 62.1%±6.5%、58.9%±6.1%，P<0.01），提示 PI3K/AKT/mTOR 信号通路被抑制。上述结果表明，CD36 可能通过调控 AMPK 与 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的平衡，影响 FLSs 的脂肪酸代谢及功能表型 —— 当 CD36 表达降低时，AMPK 通路激活可促进脂肪酸氧化，而 PI3K/AKT/mTOR 通路抑制则可减少细胞增殖与迁移，共同实现对 FLSs 功能的调控。

本研究通过细胞实验系统证实，CD36 在 FLSs 中高表达，其通过介导脂肪酸代谢重编程，维持 FLSs 的高增殖、高炎症、高迁移侵袭及抗凋亡表型，同时通过调控 AMPK 与 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的平衡，参与 FLSs 的功能调控。其中，AbMole 的 Bodipy 493/503 荧光染料在细胞内脂滴检测中发挥了关键作用，其特异性结合中性脂滴的特性的，为 CD36 调控 FLSs 脂肪酸代谢的表型分析提供了可靠、直观的实验依据，确保了脂滴检测结果的准确性与重复性。此外，本研究仅聚焦于脂肪酸代谢，CD36 是否通过调控其他代谢途径（如糖代谢、氨基酸代谢）影响 FLSs 功能，仍需进一步探究。总体而言，本研究揭示了 CD36 作为 FLSs 功能调控靶点的潜在价值，为滑膜稳态失衡的机制研究及干预策略开发提供了重要的实验基础。