球体来源的BMSC外泌体增强退行性椎间盘修复中髓核细胞簇的增殖与基质重塑

椎间盘退行性变（IDD）是引发下腰痛的主要病理基础，其发病机制核心在于髓核（NP）组织内细胞功能失衡与细胞外基质（ECM）代谢紊乱。传统观点认为，退变中的髓核细胞（NPC）处于衰老或凋亡状态，失去增殖与合成能力。然而，近年临床与基础研究的交汇逐渐揭示，退变椎间盘内并非完全失去再生潜能，而是存在一类具有增殖活性的细胞簇——髓核细胞簇（NPCCs），它们可能代表了一种内源性修复机制的前体状态。本文作者团队正是基于这一生物学现象的再认识，结合临床实践中观察到的自体髓核碎片与骨髓抽吸物（BMA）联合回植可促进椎间盘再水化的现象，系统解析其背后的细胞与分子机制，提出并验证了一种基于NPCCs与球体培养来源骨髓间充质干细胞外泌体（Sph-Exos）协同作用的组织工程策略。

研究首先从临床出发，纳入MRI分级为Pfirrmann II–IV的椎间盘突出患者，术中获取NP组织并剪碎成<1 mm³的微粒，与自体髂骨来源的BMA混合后负载于明胶海绵，再以猪源性纤维蛋白胶封装，回植至髓核腔，同时行后路动态稳定术。术后1、3、6个月的MRI随访显示，T2加权像信号逐渐增强，提示NP再水化；虽然VAS与ODI评分在两组间差异未达统计学显著，但联合策略组的改善幅度更大，提示该干预具备潜在的生物学优势。作者进一步对术中获取的不同退变等级（II–V）的NP组织进行组织学与细胞学分析，发现随着退变加重，NPCCs数量显著增加，且其EDU阳性率、迁移能力与增殖活性均优于同一等级中的单个NPC，尤其在Pfirrmann III–IV中差异最为显著。SA-β-gal染色显示，NPCCs的衰老水平显著低于单个NPC，提示其在退变微环境中仍保留更高的功能储备。

为验证NPCCs的再生潜能，作者采用部分胶原酶消化法自NP碎片中释放NPCCs，发现其可在2D条件下贴壁扩展，形成多细胞网络，并表达CD90、CD105等干性标志物及PCNA增殖抗原，且MMP9表达水平与单个NPC相当，提示其并非以ECM降解为主要特征。基于此，作者提出NPCCs可作为“种子单元”用于构建组织工程髓核（TE-NP），但其功能尚需外部生物活性因子支持。于是，研究转向BMSC外泌体的制备与功能优化。通过球体培养（3D spheroid culture）方式，作者在超低贴附条件下诱导BMSC形成球体，收集其上清中的外泌体（Sph-Exos），并与传统2D培养来源外泌体（2D-Exos）进行比较。NTA与TEM结果显示，两者粒径均分布于100–150 nm，表达CD9、CD81、TSG101等外泌体标志物，但Sph-Exos产量约为2D-Exos的10倍，且细胞摄取效率更高。进一步实验发现，Sph-Exos在体外可显著抑制P2代NPC的衰老表型，提升其增殖、迁移与ECM合成能力，表现为Ki67、COL2、Aggrecan与SOX9表达上调，而MMP9、MMP13、p53与p21表达下调。

为解析Sph-Exos的分子机制，作者对处理后的NPC进行转录组测序，发现Sph-Exos组中275个基因上调、582个基因下调，GSEA与KEGG富集分析提示其显著抑制胶原与蛋白多糖降解通路，并富集于NF-κB与FOXO信号通路。Western blot验证显示，Sph-Exos可显著下调p-P65与p-IκBα，抑制NF-κB通路激活，同时上调FOXO3总蛋白并下调其磷酸化水平，增强其转录活性。免疫荧光亦证实IL-1β表达显著降低，提示Sph-Exos通过NF-κB/FOXO3轴发挥抗炎与抗衰老作用。

在此基础上，作者构建了一种可注射的TE-NP构建体，将NPCCs与Sph-Exos共封装于GelMA水凝胶中。GelMA由明胶经甲基丙烯酸酐修饰合成，¹H-NMR与FTIR确认其成功甲基丙烯化，6%浓度在UV交联后形成稳定水凝胶，孔隙结构良好，细胞相容性优异。PKH26标记的Sph-Exos在凝胶中均匀分布，体外释放实验显示其可持续释放18天，释放曲线符合非Fick扩散模型。为进一步模拟体内力学环境，作者将构建体置于0.3 MPa静水压生物反应器中培养，发现Sph-Exos组在细胞密度、COL2表达、蛋白多糖沉积与胶原排列方面均优于2D-Exos与空白组，提示其在力学刺激下仍能维持良好的再生活性。

在体实验中，作者将构建体植入裸鼠皮下，6周后取材显示Sph-Exos组组织结构致密，细胞排列有序，蛋白多糖与COL2表达显著增强。进一步在大鼠尾椎间盘缺损模型中验证，GelMA@NPCCs/Sph-Exos组在MRI上表现出最佳的NP体积恢复与T2信号增强，组织学显示其纤维结构最少、COL2表达最高，组织学评分最低，显著优于其他组别，证实该构建体在体具备卓越的再生能力。

为揭示Sph-Exos中发挥关键作用的miRNA成分，作者对其进行miRNA测序，发现110个差异miRNA，其中hsa-miR-148a-3p与hsa-miR-152-3p表达最为显著。靶基因预测与功能验证显示，miR-148a-3p可下调MMP13与ADAMTS5表达，抑制ECM降解；miR-152-3p则抑制IL-6与TNF-α表达，间接上调FOXO3，发挥抗衰老作用。两者共同作用，协同促进NPC功能恢复与ECM重塑。

在整个实验流程中，外泌体的标记与追踪至关重要。作者使用AbMole提供的PKH26红色荧光染料对Sph-Exos进行标记，该染料可稳定插入外泌体膜结构，确保在共聚焦显微镜下清晰观察其被NPC摄取的过程。实验结果显示，PKH26标记后的Sph-Exos在12小时内即可被NPC有效内化，红色荧光信号集中于胞质区域，且Sph-Exos组的荧光强度显著高于2D-Exos组，进一步验证其更高的摄取效率与生物活性。该标记系统为后续在凝胶中追踪外泌体分布与释放提供了可靠依据，也为构建体在体再生机制的可视化研究奠定了基础。

综上所述，本研究系统揭示了NPCCs在退变椎间盘中的再生潜能，并通过球体培养技术优化BMSC外泌体的产量与功能，构建出一种基于GelMA水凝胶的NPCCs/Sph-Exos协同递送系统，显著提升了NPC的生物学功能与ECM合成能力。该研究不仅从机制层面阐明了临床观察到的再水化现象，也为未来开发可转化、可注射的椎间盘再生策略提供了坚实的理论与实验基础。值得注意的是，研究所用miRNA的靶点验证尚缺乏双荧光报告系统支持，未来仍需进一步确认其直接调控关系。同时，Sph-Exos的大规模制备、标准化与质控体系亦是其走向临床前研究的关键环节。