外泌体介导的小胶质细胞 - 星形胶质细胞相互作用

星形胶质细胞作为脑内丰度最高的非神经元细胞，兼具抗原提呈功能与神经保护作用：通过糖酵解供能、分泌神经营养因子、维持代谢稳态及促进突触发生等方式保护多巴胺能神经元，而在中枢神经系统损伤刺激下，星形胶质细胞会发生增殖与反应性增生。根据转录谱差异，反应性星形胶质细胞可分为神经毒性表型（主要为 A1 型、A1 样或神经炎症性反应性星形胶质细胞）与神经保护性表型（主要为 A2 型、A2 样），前者在有害刺激下会丢失神经保护功能，转而通过吞噬聚集蛋白、释放促炎细胞因子参与神经毒性过程。然而，星形胶质细胞向神经毒性表型转化的具体机制仍不明确。

此前研究推测星形胶质细胞可能通过内吞神经元释放的 α-syn 获得促炎表型，但直接用 α-syn 预制纤维（α-syn PFF）处理星形胶质细胞并未诱导特异性 A1 型转录反应；另有研究发现，脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞可通过分泌 IL-1α、TNFα 及 C1q 诱导 A1 型星形胶质细胞形成，进而导致多巴胺能神经元损伤，提示小胶质细胞与星形胶质细胞间存在直接对话，这种 “泛胶质” 激活是神经元损伤的重要诱因，因此阐明小胶质细胞激活及调控星形胶质细胞表型转化的机制，对解析 PD 病理进程具有重要意义。

α-syn PFF 处理的小鼠模型中，小胶质细胞激活发生于疾病早期，且激活的小胶质细胞除释放炎症细胞因子外，还会分泌大量含 α-syn 的外泌体，这些外泌体可与炎症细胞因子协同促进 α-syn 在不同脑区的传播，但外泌体是否参与小胶质细胞诱导的星形胶质细胞表型转化仍不明确。外泌体作为纳米级细胞外囊泡，携带供体细胞来源的多种分子 cargo，若小胶质细胞来源外泌体确实调控星形胶质细胞表型，其具体功能成分及 PD 病理中是否存在可干预的小胶质细胞特异性靶点，均需进一步探究。

Pellino-1（Peli1）作为一种高度保守的 E3 泛素连接酶，在调控小胶质细胞激活与神经炎症中发挥关键作用，已被证实通过调控小胶质细胞功能参与阿尔茨海默病、心源性脑卒中及多发性硬化等中枢神经系统疾病的病理进程，且在 α-syn PFF 刺激的小胶质细胞中可调节外泌体释放。基于此，本研究提出假设：Peli1 可能是 PD 中小胶质细胞 - 神经毒性星形胶质细胞对话的关键分子纽带，通过 α-syn PFF 诱导的散发性 PD 模型，系统探究激活的小胶质细胞是否通过外泌体激活神经毒性星形胶质细胞，以及 Peli1 在这一过程中的调控作用。

本研究采用体内外结合的实验设计，动物实验选用 2-3 月龄 C57BL/6JNifdc 小鼠。α-syn PFF 的制备参照 Michael J. Fox 基金会官方手册：将购买的 α-syn 单体用 D-PBS 调整浓度至 5mg/ml（基于 A280 吸光度值），在 orbital 摇床中以 1000rpm 振荡 7 天促进 fibril 形成，分装后于 - 80℃保存；使用前将分装的 α-syn PFF 用 D-PBS 稀释至 0.1mg/ml，以 2 级功率超声处理 60 个脉冲（每个脉冲约 0.5s），通过透射电镜（TEM）验证其结构。小胶质细胞耗竭采用 PLX3397（AbMole，#M4867）处理，该试剂为选择性集落刺激因子 1 受体（CSF1R）激酶抑制剂，将其按 290mg/kg 剂量混入标准饲料，小鼠在 PFF 注射前 4 周开始饲喂含 PLX3397 的饲料或对照饲料，持续至 PFF 注射后 4 周处死，期间无明显体重下降或死亡现象。

α-syn PFF 注射实验中，小鼠经麻醉后，以 0.1μl/min 的速度向右侧背侧纹状体（AP：-0.2mm，ML：+2mm，DV：-2.6mm）立体定位注射 2.5μl 超声处理的 α-syn PFF（2μg/μl），假手术组注射等量 D-PBS，注射后留针 10 分钟以确保充分吸收。外泌体纯化与给药时，为避免胎牛血清（FBS）中外泌体污染，收集上清前采用含 1% 无外泌体 FBS的培养基培养细胞；外泌体分离步骤为：首先将培养基在 4℃下以 3000g 离心 15 分钟去除细胞碎片，随后加入 1/5 体积的 ExoQuick-TC PLUS 外泌体沉淀液，4℃直立冷藏过夜；次日以 1500g 离心 30 分钟沉淀外泌体，若用于细胞处理则将外泌体重悬于培养基（体积为原培养基的 1/10），若用于制备无外泌体条件培养基则将培养基以 12000g 超速离心 90 分钟，收集上清液。小鼠体内注射外泌体时，根据 BCA 定量结果将外泌体重悬于 D-PBS 至终浓度 10μg/μl，每只小鼠每部位立体定位注射 30μg 外泌体（3μl），注射部位为纹状体的两个位点（AP：+0mm，ML：+2mm，DV：-2.6mm；AP：+1mm，ML：+1.5mm，DV：-3mm），注射速度 0.1μl/min；1 个月后处死小鼠，脑组织用 4% 多聚甲醛（PFA）固定过夜，经 10%-20%-30% 蔗糖溶液梯度脱水，OCT 包埋后制成 30μm 冷冻切片，保存于 30% 蔗糖：甘油 = 1:1 的混合液中，置于 - 20℃备用。

外泌体的 PKH67 标记采用 PKH67 染料（AbMole，#M21704），将 10 个 100mm 培养皿的 BV-2 细胞培养上清经超速离心获得的外泌体用稀释液 C 重悬，与 PKH67 染料孵育后，按说明书推荐用培养基淬灭，随后在底部含 30% 蔗糖溶液的离心管中以 180000g 离心 2 小时去除多余染料，再通过 10kDa 截留分子量的滤柱以 3000g 离心 40 分钟浓缩，浓缩液按前述方法用 ExoQuick-TC PLUS 外泌体沉淀液处理，最终将外泌体重悬于 10μl D-PBS，注射至纹状体的上述两个位点。

药物处理实验中，小胶质细胞的 GW4869 处理采用 GW4869（AbMole，#M4974），该试剂通过抑制中性鞘磷脂酶减少外泌体生成，将其粉末用 DMSO 溶解制备 1.5mM 储存液，使用时在培养基中稀释至 3μM，处理小胶质细胞 24 小时后再加入 α-syn PFF 或 D-PBS。胶质细胞的 α-syn PFF 与 LPS 处理步骤为：将超声处理的 α-syn PFF 用培养基稀释至 2μg/ml，孵育原代小胶质细胞或 BV-2 细胞 24 小时，次日用 PBS 洗涤 3 次以彻底去除 α-syn PFF，更换新鲜培养基继续培养 24 小时；在收集培养基纯化外泌体前，先加入 1μg/ml LPS处理 3 小时，随后加入 5mM ATP（AbMole，#M5432）处理 15 分钟，以模拟炎症微环境下的细胞激活状态。此外，向星形胶质细胞中加入 3ng/ml IL-1α与 30ng/ml TNF-α诱导神经毒性转化，6 小时后更换新鲜培养基，继续培养 24 小时后收集上清，以 3000g 离心 15 分钟去除细胞碎片，通过 10kDa 截留分子量的滤柱浓缩至 15 倍体积，加入原代小胶质细胞中，24 小时后提取蛋白检测 Peli1 表达。

研究进一步探究了小胶质细胞 Peli1 对 AM-Exo 诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞的调控作用。鉴于 Peli1 在调控小胶质细胞激活与外泌体释放中的关键作用，且抑制 Peli1 可减少外泌体释放，本研究首先检测 Peli1 在 α-syn PFF 模型中的表达定位，免疫荧光显示 Peli1 免疫反应主要定位于纹状体区的小胶质细胞，α-syn PFF 处理可显著增强 Peli1 表达，且主要与激活的小胶质细胞共定位；而纹状体区的星形胶质细胞与皮质神经元中，即使经 α-syn PFF 处理，Peli1 免疫反应仍维持低水平，提示 α-syn PFF 注射小鼠中 Peli1 主要在小胶质细胞中表达。体外实验中，BV-2 细胞经 α-syn PFF 处理后，Peli1 表达显著升高，进一步证实小胶质细胞中 Peli1 的诱导表达；此外，人黑质区单核转录组数据显示，PD 患者的 Peli1 RNA 水平高于健康对照，提示 Peli1 与 PD 的关联性。

为验证 Peli1 作为小胶质细胞特异性靶点调控神经毒性星形胶质细胞转化的可能性，采用 siRNA 在 BV-2 细胞中敲低 Peli1（Peli1 KD），将不同处理的 BV-2 细胞分泌的外泌体与原代星形胶质细胞共孵育，结果显示，AM-Exo 可上调星形胶质细胞的泛反应性与 A1 型转录标志物，而 Peli1 KD 可显著减弱这些标志物的上调；免疫荧光显示，AM-Exo 处理使 C3d 阳性星形胶质细胞比例升高、S100 阳性比例降低，Peli1 KD 可逆转这一表型；Western blot 显示，AM-Exo 诱导的 C3d 蛋白表达升高，可被 Peli1 KD 阻断，S100 蛋白水平则在 Peli1 KD 后恢复；ELISA 结果显示，AM-Exo 处理的星形胶质细胞上清中 TNFα、IL-6、IL-1β 浓度升高，Peli1 KD 可显著降低这些细胞因子浓度，证实体外条件下抑制小胶质细胞 Peli1 可抑制外泌体介导的神经毒性星形胶质细胞转化。

体内实验中，将不同处理的 BV-2 细胞分泌的外泌体立体定位注射到小鼠纹状体，采用 PKH67 标记外泌体验证注射效果，结果显示注射后 7 天，PKH67 信号扩散至胼胝体、皮质及邻近区域，高倍共聚焦显微镜观察到纹状体与 SNpc 区的星形胶质细胞内存在 PKH67 信号，证实星形胶质细胞可摄取外泌体，且外泌体可从纹状体扩散至 SNpc。注射后 1 个月，RM-Exo 仅诱导纹状体区轻微 GFAP 免疫反应，且注射部位周围仅出现少量 C3d 阳性表型，而 AM-Exo 注射导致纹状体区 GFAP 免疫反应显著增强，且 C3d 阳性星形胶质细胞广泛分布；小胶质细胞 Peli1 KD 后，AM-Exo 诱导的 GFAP 阳性与 C3d 阳性星形胶质细胞显著减少，神经毒性星形胶质细胞转化得到缓解。SNpc 区中，RM-Exo 注射未影响 GFAP 与 C3d 免疫反应，AM-Exo 注射则升高 GFAP 与 C3d 阳性星形胶质细胞比例，而小胶质细胞 Peli1 KD 可抑制这一效应，提示 AM-Exo 可介导远距离胶质细胞通讯，且 Peli1 在调控小胶质细胞外泌体诱导的神经毒性星形胶质细胞转化中发挥关键的体内作用。

综上，本研究揭示了小胶质细胞来源外泌体在 PD 神经炎症调控中的新作用，证实 α-syn PFF 激活的小胶质细胞释放的外泌体可诱导星形胶质细胞向神经毒性表型转化，进而加剧神经元损伤；明确了 AM-Exo 中携带的促炎因子与病理性 α-syn 寡聚体是介导这一转化的关键成分，并首次证实 Peli1 作为小胶质细胞特异性靶点，在调控外泌体介导的小胶质细胞 - 星形胶质细胞相互作用中的核心作用；此外，研究还发现神经毒性星形胶质细胞可通过分泌促炎因子上调小胶质细胞中 Peli1 的表达，形成正反馈环路，进一步放大神经炎症效应。这些发现不仅丰富了 PD 神经炎症的病理机制，还为 PD 相关神经炎症的干预提供了新的潜在靶点。