邻近标记技术：为病毒受体研究注入新活力

病毒入侵宿主细胞通常依赖于其表面蛋白与宿主细胞受体的特异性结合。这些受体决定了病毒的组织嗜性和宿主范围，对病毒感染机制和临床结果有重要影响。例如，新型冠状病毒SARS-CoV-2正是通过其刺突蛋白（S蛋白）识别并结合人细胞表面的ACE2受体，从而进入细胞引发感染。然而，病毒与宿主受体的相互作用往往是短暂而动态的，传统的蛋白互作研究手段（如免疫共沉淀等）难以高效捕获这类瞬时弱相互作用，也难以鉴定低丰度或疏水性的膜蛋白受体。因此，邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）应运而生，通过在活细胞内对邻近的蛋白进行生物素标记并结合质谱分析，实现对蛋白互作网络的高效鉴定。其中，基于改良生物素连接酶的TurboID技术因其标记速度快、灵敏度高等优势，已成为近年来研究病毒受体的有力工具。

一、邻近标记技术

邻近标记技术的核心思想是利用一种能够在活细胞内将生物素共价连接到邻近蛋白上的酶，通过基因工程将其与目标蛋白融合表达，从而在细胞原位标记目标蛋白周围的分子。TurboID正是这一策略的代表技术之一，其原理是将改造后的生物素连接酶TurboID与诱饵蛋白（如病毒受体）融合表达于细胞中。当在细胞培养基中加入外源生物素时，TurboID酶被激活，以ATP为辅因子将生物素转化为高反应性的生物素-5’-AMP中间体，并将其“抛射”到周围纳米范围内的蛋白质上，使邻近的蛋白共价结合生物素标记。经过一定时间的标记后，细胞裂解并通过链霉亲和素磁珠富集所有被生物素标记的蛋白，最后利用质谱分析鉴定出这些邻近蛋白的身份。通过与未加生物素或对照诱饵的样本比较，可以筛选出与诱饵蛋白在空间上接近的候选互作蛋白。

该技术具有高空间特异性和时间分辨率，能够有效识别与目标蛋白在空间上相邻的蛋白质，尤其适用于研究弱或瞬时的蛋白质相互作用。其动态捕捉能力使其在研究病毒与受体之间短暂而关键的相互作用时具有独特优势，可捕捉病毒与受体之间短暂而弱的相互作用，简化数据筛选过程。

二、邻近标记技术在病毒受体识别中的应用

案例：TurboID在SARS-CoV-2受体识别中的应用

新型冠状病毒SARS-CoV-2的出现引发了全球大流行，其受体识别机制一直是研究热点。已知SARS-CoV-2主要通过刺突蛋白结合人ACE2受体进入细胞，但有证据显示可能存在其他辅助受体或途径参与其感染过程。为了系统性地寻找SARS-CoV-2的共受体，中国科研团队首次将TurboID邻近标记技术应用于病毒受体鉴定研究。

研究选择ACE2作为诱饵蛋白，将其与TurboID酶融合，并构建了稳定表达ACE2-TurboID融合蛋白的人肺癌细胞系A549。选择A549细胞是因为其本身ACE2表达较低，对SARS-CoV-2不易感，从而降低内源性ACE2干扰，使实验更可控。随后，研究将表达ACE2-TurboID的A549细胞与携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型病毒共孵育，并在培养基中加入生物素和ATP以启动TurboID的催化活性。在病毒与细胞接触的短时间内（例如15分钟），TurboID将ACE2周围的宿主膜蛋白迅速生物素化标记。标记完成后，裂解细胞，利用链霉亲和素磁珠富集所有被标记的蛋白，并通过LC-MS/MS分析鉴定这些蛋白的身份。为了确保结果的可靠性，实验同时设置了未感染假病毒的对照组，以区分病毒存在与否时的差异标记蛋白。

携带 ACE2 融合 TurboID 的慢病毒质粒的构建和验证

通过对质谱数据的分析，研究发现了一批在病毒感染组中显著富集的宿主蛋白，其中最引人注目的是AXL蛋白，在对照组中几乎未被标记，而在病毒存在时被强烈生物素化。进一步的功能实验证实了AXL的作用：当在细胞中过表达AXL时，SARS-CoV-2假病毒的感染效率显著提高；反之，使用AXL的特异性抑制剂或敲低AXL表达后，病毒感染水平明显下降。免疫荧光共定位实验也观察到，在病毒附着早期，AXL与病毒颗粒在细胞膜上共定位，随后共同进入细胞内吞囊泡。这些结果强有力地表明，AXL能够作为SARS-CoV-2的一个共受体，协助病毒通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。总的来说，通过TurboID邻近标记技术，研究者成功找到了SARS-CoV-2的一个新的共受体AXL，并描绘了ACE2周围的宿主蛋白图谱。这一案例充分展示了TurboID在病毒受体识别中的威力：快速捕获病毒-受体相互作用的瞬间场景，高灵敏鉴定出传统方法可能遗漏的共受体分子，为阐明病毒入侵机制提供了全新视角。

三、总结

TurboID介导的邻近标记技术在病毒受体研究中的成功应用，预示着其在未来病毒学领域具有广阔的发展前景。以下几个方面值得重点关注：

• 发现更多未知病毒受体与宿主因子：目前仍有许多病毒的受体尚未明确，尤其是一些新兴病毒。TurboID技术可以用于筛选这些病毒的潜在受体。
• 解析病毒入侵的动态过程：病毒入侵往往是多步骤的动态过程，包括粘附、受体结合、内吞、膜融合等阶段。TurboID的快速标记特性使其可以用于“时间切片”式地研究这些过程。
• 多病毒、多受体相互作用网络研究：许多病毒并非只利用单一受体，而是存在“受体家族”或受体复合物。此外，不同病毒之间可能共享某些宿主因子。邻近标记技术可以用于构建病毒-宿主相互作用网络。
• 在体内和临床样本中的应用拓展：虽然目前TurboID主要用于培养细胞的研究，但随着技术优化，其有望应用于更接近真实感染场景的环境中。未来结合组织透化和高分辨质谱成像技术，邻近标记甚至可能直接用于分析患者样本中病毒-宿主相互作用的微环境。

综上所述，TurboID介导的邻近标记技术为病毒受体识别和病毒-宿主相互作用研究打开了一扇新的窗口。它以快速、全面的方式揭示了活细胞内病毒入侵过程中发生的分子事件，在SARS-CoV-2等病毒的研究中已展现出独特优势。随着技术的不断完善和应用的不断拓展，邻近标记技术有望帮助我们发现更多病毒的受体，阐明病毒感染机制的细节，并为抗病毒药物和疫苗开发提供新的靶点和思路。可以预见，在病毒学与蛋白质组学交叉的前沿领域，邻近标记技术将继续发挥举足轻重的作用，推动我们对病毒世界的认识进入一个新的视界。