热蛋白质组学分析技术在现代生命科学中的应用领域探析

更多详细信息请见：最经典、主流的药物靶点筛选技术——TPP热蛋白组分析

蛋白质是生命活动的直接执行者和功能体现者，其结构与功能的动态变化调控着细胞乃至整个生物体的各项生理及病理过程。热蛋白质组学分析(Thermal Proteome Profiling, TPP) 作为一项前沿的化学蛋白质组学技术，近年来在生命科学领域崭露头角。它通过系统性评估蛋白质在接近生理相关环境下（如活细胞、组织甚至体液中）的热稳定性变化，提供了一个独特的窗口，以全面洞察蛋白质的状态、蛋白质之间相互作用，以及这些相互作用如何影响蛋白质的稳定性与功能。

TPP技术的核心价值在于其能够在无需对小分子进行化学标记的情况下，无偏倚地、规模化地探测蛋白质组范围内的相互作用，并揭示这些相互作用对蛋白质构象和稳定性的直接影响。这一特性使得TPP不仅成为理解复杂生命活动和疾病发生发展分子机制的有力工具，更在药物靶点发现、药物作用机制解析以及候选药物筛选等新药研发的关键环节展现出巨大潜力。

一、热蛋白质组学分析

热蛋白质组学分析(TPP) 是一种强大的技术手段，它巧妙地将细胞热迁移分析(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA) 的核心原理与质谱技术相结合，从而实现了在蛋白质组规模上对蛋白质热稳定性的系统性分析。TPP的根本出发点是蛋白质的热稳定性。当蛋白质暴露于逐渐升高的温度时，其三维结构会发生解折叠并倾向于聚集沉淀，这一过程中，蛋白质从可溶状态转变为不可溶状态的温度特性，即为其热稳定性的一种体现。TPP技术通过精确控制温度梯度，并结合定量质谱分析在不同温度下保持可溶状态的蛋白质丰度，从而为蛋白质组中的每一个可检测蛋白质绘制出熔解曲线。借助高分辨率的定量质谱技术，TPP能够同时监测细胞裂解液、完整细胞乃至组织样本中成千上万种蛋白质的热稳定性变化，这种全景式的扫描使得研究者能够无偏倚地发现药物的直接靶点、脱靶靶点，以及由这些直接相互作用引发的下游蛋白质稳定性改变，从而揭示复杂的生物学效应网络。

二、热蛋白质组学分析的应用及案例

1、热蛋白质组分析在探索疾病机制中的应用

TPP技术通过比较疾病模型与健康对照组之间蛋白质组热稳定性的差异，为深入理解疾病的发生发展提供了新的视角。蛋白质的热稳定性直接反映了其结构状态和所处的分子环境，TPP可以检测到由于疾病引起的蛋白质构象改变、异常的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs)、蛋白质-代谢物相互作用，以及信号通路活性的变化。

案例：热蛋白质组分析在白血病研究中的应用

一项发表于Nature Chemical Biology的研究，对20种不同亚型的B细胞儿童急性淋巴细胞白血病细胞系 (cALL) 进行了热蛋白质组分析。通过结合高分辨率等电聚焦分离技术 ，研究人员实现了前所未有的肽段覆盖度，从而能够识别和区分来自同一基因的不同蛋白质异构体 的热稳定性。他们发现了15,846个功能性蛋白质异构体群体，并揭示了这些异构体在不同cALL亚型、不同B细胞发育阶段的热稳定性差异，还将这些差异与细胞对528种抗肿瘤化合物的敏感性联系起来，为理解cALL的异质性和寻找新的治疗靶点提供了重要线索。

2、热蛋白质组分析在生物标志物发现中的应用

蛋白质热稳定性的改变是蛋白质功能状态的直接反映，因此，TPP技术在发现用于疾病诊断、预后判断和疗效预测的新型生物标志物方面具有巨大潜力。通过比较疾病患者与健康人群，或不同疾病亚型、不同疾病阶段患者样本中蛋白质组的热稳定性谱，可以筛选出那些热稳定性发生特异性改变的蛋白质，这些蛋白质有望成为新的生物标志物。

案例：蛋白质异构体特异性标志物

如前述cALL研究所示，TPP结合高分辨分离技术能够区分不同蛋白质异构体的热稳定性。由于不同异构体可能具有不同的功能甚至在疾病中发挥相反作用，因此基于异构体热稳定性的标志物可能比基于总蛋白水平的标志物更为精准和特异。研究发现Crk样蛋白 (CRKL) 的一种蛋白质异构体的热稳定性与细胞对BCR-ABL激酶抑制剂的敏感性呈正相关，提示CRKL的热稳定性特征可能作为预测此类药物疗效的生物标志物。

3、热蛋白质组分析在药物靶点筛选中的应用

TPP能够在接近生理的条件下，无需对药物分子进行标记即可鉴定小分子药物的直接作用靶点，同时，它还能揭示药物引起的下游信号通路中蛋白质热稳定性的变化，即间接影响的蛋白质。通过比较药物在完整细胞和细胞裂解物中诱导的蛋白质热稳定性变化，可以有效区分药物的直接结合靶点和由于细胞内信号传导或代谢变化导致的间接效应蛋白。在细胞裂解物中，细胞结构和代谢活动被破坏，观察到的热稳定性变化更可能源于药物与蛋白质的直接相互作用。

案例：天然产物藤黄酸的靶点鉴定：

北京大学药学院的曾克武和屠鹏飞团队利用TPP技术，结合SILAC（细胞培养中氨基酸稳定同位素标记）技术，成功鉴定了天然产物藤黄酸  在前列腺癌细胞中诱导细胞焦亡的关键分子靶点为CNPY3，这一发现为理解藤黄酸的抗肿瘤机制及开发新的治疗策略提供了重要依据。

4、热蛋白质组分析在疾病诊断中的应用

传统的疾病诊断往往依赖于临床症状、影像学和少数几个生物标志物，TPP有望通过提供更全面的蛋白质功能状态信息，为疾病的精准诊断和亚型分类带来突破。每个细胞或组织类型在特定生理或病理状态下，其蛋白质组可能展现出独特的整体热稳定性图谱。通过分析患者样本中蛋白质组的特异性热稳定性特征，或特定蛋白质异构体的热稳定性变化，有望开发出新的诊断方法，用于疾病的早期识别或区分具有不同分子特征的疾病亚型。

案例：香港大学支志明院士团队利用TPP发现存于细胞骨架中的Girdin蛋白是多种难治性和易转移癌症的肿瘤抑制因子，喹啉并[3,4-B] 喹啉类小分子可选择性靶向Girdin蛋白并激活其抑制肿瘤的活性，为开发治疗转移性癌症的创新疗法提供了新的靶点。

三、总结

热蛋白质组学 (TPP) 技术，作为一项能够在原生细胞环境或复杂生物样本中，无偏倚、规模化地研究蛋白质热稳定性及其受配体调控的创新方法，已经深刻地改变了我们探索蛋白质功能和相互作用的方式。它巧妙地将蛋白质热变性的基本生物物理原理与先进的定量质谱技术相结合，为我们打开了一扇观察蛋白质动态世界的新窗口。

TPP技术的核心价值在于其能够提供超越传统蛋白质丰度分析的功能性信息。在生物医学研究领域，TPP助力科学家深入揭示疾病的分子机制，从蛋白质异构体的细微差异到金属离子调控的复杂网络，再到代谢物对关键酶活性的调控，不断刷新我们对疾病发生发展的认知，并为新型生物标志物的发现提供了丰富的源泉。在药物研发领域，TPP从根本上加速了新药创制的进程，无论是无偏倚的靶点发现与验证、脱靶效应的系统评估，还是药物作用机制的精细解析和先导化合物的优化，TPP都扮演了关键角色，特别是在天然产物等复杂体系的研究中展现出独特优势。在临床应用方面，尽管仍处于发展初期，但TPP在疾病精准诊断、预后评估以及指导个体化医疗策略制定方面已显露出巨大的潜力，Tissue-TPP和Blood-TPP等技术的出现更是将其向临床实践推进了一大步。随着生命科学研究的不断深入和精准医疗需求的日益增长，热蛋白质组学技术必将在全球科研人员的共同努力下，通过持续的技术革新和多学科交叉融合，取得更大的突破。

参考文献：

1.Kurzawa N, Leo IR, Stahl M, et al. Deep thermal profiling for detection of functional proteoform groups. Nat Chem Biol. 2023;19(8):962-971. doi:10.1038/s41589-023-01284-8

2.Zhang XW, Li L, Liao M, et al. Thermal Proteome Profiling Strategy Identifies CNPY3 as a Cellular Target of Gambogic Acid for Inducing Prostate Cancer Pyroptosis. J Med Chem. 2024;67(12):10005-10011. doi:10.1021/acs.jmedchem.4c00140

3.Ruan ML, Ni WX, Chu JCH, et al. Iridium(III) carbene complexes as potent girdin inhibitors against metastatic cancers. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(25):e2316615121. doi:10.1073/pnas.2316615121