LiP-MS技术在代谢物-蛋白质相互作用研究中的应用：以牛磺酸对胰腺β细胞衰老影响研究为例

更多详情请见：LiP-MS药物靶点筛选技术 

胰腺β细胞衰老是导致2型糖尿病发病的重要因素之一。β细胞功能随年龄增长逐渐衰退，细胞周期停滞以及促炎性细胞因子分泌增加，这些衰老相关分泌表型（SASP）会进一步削弱β细胞功能，导致胰岛素分泌不足。因此，深入理解β细胞衰老的分子机制对于开发糖尿病治疗策略具有重要意义。

代谢组学研究近年来取得显著进展，科学家们发现代谢物不仅是细胞代谢的产物，还作为信号分子调节多种生物途径。然而，代谢物与蛋白质之间的相互作用复杂且动态，传统方法难以捕捉这些瞬时相互作用。LiP-MS技术作为一种新兴的分析手段，通过有限蛋白酶解和质谱分析，能够有效识别小分子代谢物与蛋白质之间的相互作用。LiP-MS技术具有高分辨率与高灵敏度，能够检测到低丰度的代谢物-蛋白质相互作用。它通过捕获代谢物与蛋白质之间瞬时或动态的相互作用，为研究代谢物在细胞生理和病理过程中的作用提供了新的视角。

案例：LiP-MS成功鉴定牛磺酸在延缓细胞衰老中的关键靶点

本研究旨在探讨牛磺酸（Taurine）对胰腺β细胞衰老的影响及其潜在机制，特别是通过LiP-MS技术揭示牛磺酸与蛋白质之间的相互作用。牛磺酸是一种非蛋白质氨基酸，已被证明在多种细胞类型和组织中具有抗衰老作用，但对于其在β细胞衰老中的作用尚不清楚。

研究采用了LiP-MS技术来识别牛磺酸与β细胞中蛋白质的相互作用。具体实验步骤如下：

1.细胞裂解和预处理： 从INS-1E细胞（一种广泛应用于糖尿病研究的胰岛β细胞模型）中提取蛋白质，使用Zeba Spin Desalting Columns去除内源性小分子，确保后续实验的准确性。

2.孵育与有限蛋白酶解： 将提取的蛋白质与1 mM牛磺酸孵育10分钟，随后加入蛋白酶K进行5分钟的有限蛋白酶解。在这里，蛋白酶K用于切割未与牛磺酸结合的蛋白质部分，而牛磺酸结合区域因受到保护而免于被切割。

3.停止酶解反应： 酶解后，通过加热至98°C灭活蛋白酶，终止反应，并迅速冷却样品。

4.样品处理： 使用胰蛋白酶对蛋白质片段进行进一步消化，生成适合质谱分析的肽段。

5.质谱分析： 使用Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Mass Spectrometer对肽段进行分析，确定与牛磺酸相互作用的蛋白质及其具体结合位点。该质谱仪具有高分辨率和高灵敏度，能够准确检测到低丰度的代谢物-蛋白质相互作用。

研究结果：

1.牛磺酸结合蛋白的发现： 通过LiP-MS技术，研究者发现了牛磺酸与CDKN2AIP蛋白结合。CDKN2AIP是一种已知的p53正调节因子，能够增强p53的稳定性和表达水平，从而在细胞衰老中发挥重要作用。

2.分子对接模拟： 研究者进一步利用分子对接模拟预测牛磺酸与CDKN2AIP的结合位点主要在PRO484、LEU485和LYS486残基。这些残基在CDKN2AIP与p53的结合中起着关键作用，因此牛磺酸的结合可能影响CDKN2AIP与p53的相互作用。

3.功能验证： 通过一系列后续实验，药物亲和响应靶标稳定性（DARTS）分析、免疫共沉淀（Co-IP）实验等，研究验证了牛磺酸通过与CDKN2AIP结合，抑制其与p53的相互作用，降低p53的稳定性和表达水平，从而减轻β细胞衰老。这些实验结果表明，牛磺酸能够有效抑制p53依赖的衰老程序，具有潜在的抗衰老作用。

鉴定胰腺β细胞中牛磺酸与CDKN2AIP结合

总结：

本研究不仅揭示了牛磺酸在胰腺β细胞衰老中的保护作用，还展示了LiP-MS技术在解析代谢物-蛋白质相互作用中的强大能力。这一发现为糖尿病等代谢性疾病的研究和治疗提供了新的视角和潜在靶点，表明通过调节代谢物-蛋白质相互作用，可能开发出新的治疗策略以延缓或改善与衰老相关的疾病。未来，LiP-MS技术有望在更广泛的研究领域中应用，为深入理解细胞代谢和信号转导机制提供重要支持。