CETSA技术的实验原理及流程

在药物研发领域，蛋白质与小分子药物的相互作用至关重要。LiP-MS技术以其高通量和高分辨率在靶点筛选中表现出色。然而，初步筛选后的靶点验证同样关键，此时CETSA技术凭借独特原理和广泛应用成为关键工具。CETSA通过检测药物处理后靶蛋白的热稳定性变化，直接验证药物与靶蛋白的结合，无需蛋白纯化或标记。这种基于完整细胞环境的技术，不仅提高了靶点验证的可靠性，还为药物筛选、机制研究和临床转化提供了有力支持。CETSA的独特之处在于其“全细胞”策略，使研究者能够在接近生理的条件下研究药物与靶点的真实相互作用。这不仅帮助精准确认药物的正确靶点，还加速了新药设计与优化。本文将详细介绍CETSA的实验原理和方法，助力您的研究。

CETSA实验原理

CETSA技术的核心原理基于配体诱导的靶蛋白热稳定化效应。当药物与靶蛋白结合时，药物分子通过与靶蛋白的特异性相互作用增强其热稳定性，从而导致靶蛋白的热变性温度（Tm）升高。这意味着，结合药物后的靶蛋白需要更高的温度才能发生变性沉淀。通过检测靶蛋白在不同温度下的热稳定性变化，可以推断药物是否与靶蛋白结合。最终，利用蛋白免疫印记法（Western blotting），可以检测到与药物结合的靶点蛋白，从而验证药物与靶蛋白的相互作用。

CETSA实验原理图

CETSA实验步骤

1.细胞的选择：选择合适的细胞系进行培养并确保细胞处于良好的生长状况。

2.药物处理：将细胞与待测药物及对照组溶剂进行孵育，确保药物与靶蛋白充分结合。

3.细胞采集：首先收集细胞，并用含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液进行洗涤，以防止蛋白降解。随后，将细胞重悬于PBS中。

4.加热处理：将细胞分装到多个PCR管中，并保证每管含有相同数量的细胞。将PCR管置于热循环器中，在不同的温度(37-67℃)梯度下加热5-15分钟，使蛋白质变性；

5.细胞裂解：将加热后的细胞重悬于NP40缓冲液中，随后进行三次液氮冻融循环以确保细胞彻底裂解。裂解完成后，将细胞悬液以4℃、20000×g离心20分钟，分离上清液和沉淀物。上清液中含有完整的、未降解的蛋白质，而沉淀物则包含已经降解的蛋白质。

6.蛋白检测：Western Blotting：取适量上清液，加入等量的2×SDS Loading Buffer，于金属浴中95℃处理10分钟以使蛋白变性；随后进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将其转印至PVDF膜上。使用特异性抗体进行免疫印迹分析，以检测目标蛋白的表达水平。也可将上清液送至如谱度众合等专业生物技术公司进行蛋白免疫印记实验。

7.数据分析：通过分析不同温度下蛋白质的溶解度或丰度变化，绘制熔解曲线。蛋白质与配体结合会使熔解曲线发生位移，从而反映蛋白质热稳定性的变化

 CETSA流程图

CETSA的应用场景

1.药物靶点的验证

CETSA能够验证药物是否与预期的靶蛋白结合，通过比较药物处理组和对照组的蛋白降解情况，可以确定药物与靶蛋白的结合效率。此外，CETSA还可以用于检测药物的脱靶效应，即药物是否与非预期的蛋白结合，这有助于评估药物的安全性和特异性。

2.蛋白—蛋白相互作用

大多数细胞生物学过程的本质是蛋白质间的相互作用，CETSA技术通过比较单个和复合蛋白质热稳定性判断其相互作用及强弱，可用于研究信号转导通路。

3.疾病诊断与生物标志物发现

在疾病的研究过程中，CETSA技术可用于组织裂解液，对比正常和病变组织蛋白质热稳定性差异，筛选生物标志物，如可以从肿瘤组织中筛选出热稳定性不同的蛋白质可用于肿瘤诊断。

4.监测细胞生理状态变化

细胞在不同生理状态下蛋白质组会有不同的变化，CETSA技术能捕捉这些变化。如细胞氧化应激时，检测抗氧化蛋白质熔解曲线可了解其应激状态。

5.药物疗效评估

CETSA技术可以分析药物处理后的组织裂解液蛋白质变化，可直观地反映药物的疗效。如神经系统疾病药物研究，通过观察脑组织裂解液中神经功能相关蛋白质热稳定性，从而判断药物作用。

CETSA技术的优势与局限性

一、优势

1. 生理相关性：接近生理条件检测，还原蛋白质状态和相互作用，避免干扰，保证结果真实可靠。
2. 无标记检测：无需复杂标记，减少步骤和干扰，降低成本，提高效率。
3. 高通量潜力：与质谱结合可一次分析大量蛋白质，实现蛋白质组系统性研究。
4. 直接评估蛋白靶点结合位点：能够在细胞或组织水平直接评估药物与靶点的结合，适用于药物靶点验证、脱靶效应检测以及高通量药物筛选。

二、局限性

1. 灵敏性有限：细胞中不是所有的相互作用变化都足以产生CETSA位移。
2. 缺乏结构信息：在蛋白质存在多个相互作用对象时通常无法提供蛋白质与配体结合的具体结构信息。
3. 细胞定位信息缺失：无法直接提供药物在细胞内的具体定位信息，需要结合其他技术（如荧光成像）进行进一步研究。

总结

CETSA是一种前沿生物技术，无需标记或修饰蛋白质，可在生理条件下直接评估药物与靶点的结合。其优势在于提供真实生物学过程的结果，适用于高通量筛选和靶点验证，并可与其他技术结合拓展应用。尽管存在灵敏度和结构信息获取的局限性，但CETSA在药物开发、疾病机制研究及天然产物靶点鉴定等领域潜力巨大，未来有望通过技术优化和协同应用发挥更大作用，为生物医学研究和新药研发提供高效精准的解决方案。