【整理】蛋白样品制备方法学评估

蛋白质样品的制备，是蛋白质研究的第一步，不论后续采用何种分离或鉴定手段，样品制备都是重要步骤。

蛋白质样品制备的意义

1. 生物的蛋白质种类多达 10 万种以上，样品中的蛋白质种类也可达到1万种以上，但大部分蛋白质的拷贝数很少，因此通过样品制备起到浓缩蛋白质的作用。

2. 去除样品中各种非蛋白质的影响。

 

如何进行蛋白质的制备

蛋白样品制备包括蛋白质的分离，提取和纯化。从各类研究角度而言，样品制备都要尽可能获得所有样品中的蛋白质，但是由于蛋白质种类多，丰度不一，物化特性多样等因素，要到达真正的完全蛋白质制备是非常困难的。

 

在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面试验中弥补回来的！

样品制备的原则: 

1. 尽可能采用简单的方法进行样品的制备。

2. 尽可能提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部处于溶解状态，且稳定可重复。

3. 尽可能减少蛋白的降解。

4. 根据下游实验选择决定提取蛋白的方法，例如提取变性还是活性蛋白，提取总蛋白还是亚细胞结构组分蛋白。

5. 尽量去除干扰下游应用的杂质，包括但不仅限于核酸，组织碎片，或某些高丰度无关蛋白。

 

样品制备的基本流程： 

1. 样品的破碎

2. 样品的裂解

3. 杂质的去除及蛋白质溶液的获取

 

样品的破碎

为了完全分析细胞内蛋白，样品必须经过有效的破碎，破碎方法的选择依赖于样品来源不同（如组织，固定组织，难研磨组织，脂肪，菌体）而不同，同时也依赖于提取蛋白的类型（如是获取总蛋白还是特殊的亚细胞结构组分）。

通常组织样品和微生物样品都需要进行破碎处理，而细胞样品不需要。破碎可以通过渗透，冻融，酶解，超声，高压，液氮研磨，机械匀浆，玻璃珠匀浆等方式完成。选择破碎方式时也要考虑使用的裂解液配方是否可以完美的配合，以得到最佳的提取效果。提取总蛋白时需要尽量的破碎样品释放蛋白，而特殊的亚细胞结构分离则需要根据提取方法采用合适的破碎方式。

 

提示：内源性的蛋白酶通常存在于细胞质内，在细胞破碎时可能会释放出来，导致某些蛋白质的降解，从而影响下游实验结果，因此可在细胞裂解前添加蛋白酶抑制剂加以保护。

 

扩展阅读：【实验技巧】蛋白酶抑制剂选择及添加---那些年你该学会的实验系列（八）

 

样品的裂解

 

样品裂解是指对蛋白质进行增溶性溶解的过程，可通过破坏蛋白质与蛋白质，蛋白质与非蛋白质之间的相互作用完成。通常裂解液中会添加表面活性剂，不同的裂解液配方所能溶解和获取的蛋白种类和得率会有较大差别，所得到的蛋白谱也会不同，所以看似简单的样品裂解却是决定整个实验成败的关键点。优质的裂解液配方既能实现蛋白质间的良好分离，又不影响下游实验。 

扩展阅读：WB 样品制备大揭秘，不同裂解液，不同方法结果报告出炉！

 

去除杂质和蛋白质获取

蛋白样品中的杂质主要包括核酸，脂类，组织碎片等，这些杂质均会干扰下游实验。特别是核酸杂质会增加样品的粘度，可能会引起下游实验中凝胶孔堵塞，核酸与蛋白结合阻碍聚集，银染或 WB 背景过高等问题，所以需尽量去除杂质。去除杂质后即可获得蛋白质溶液。传统的提取方法（如RIPA裂解液和溶液法提取的试剂盒）缺少有效的杂质去除步骤，通过离心取上清的方式获取的蛋白质无法完全去除杂质，且获得的蛋白纯度较低，同时也会损失较多蛋白质，从而影响蛋白的提取质量，改变样品中真实的蛋白谱。Invent 新一代柱式总蛋白提取法突破了传统方法的困境，利用离心管柱技术，可有效去除蛋白中的核酸杂质，提高蛋白纯度，配合优化的裂解液配方，无蛋白丢失，一管式操作，可快速获取高质量的蛋白质样品。降低下游检测难度，提高数据真实性。 

 

亚细胞结构分离

 

大部分实验通常可以用总蛋白组分进行蛋白质的分析，但是涉及到某些低丰度蛋白或者蛋白细胞定位和蛋白转运研究时，则需要进行样品的亚细胞结构分离，也就是将样品中的蛋白分成几个组分，分别进行蛋白质的研究。根据蛋白质在细胞中不同的细胞定位进行分离，可分离细胞核，细胞膜，内质网，线粒体，高尔基体，溶酶体，内体等结构。亚细胞结构分离不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量，降低检测难度，还可以针对某一细胞组分的蛋白质进行分析。
 传统的亚细胞结构分离主要是将样品匀浆后，进行密度梯度离心分离不同组分，传统提取方法操作步骤多而复杂，所需起始原料量极大，需使用超高速离心及配制密度梯度溶液，得率较低，失败率高，使得下游实验困难增加，阻碍深入研究进程。为了加速科研者在蛋白领域深入研究的脚步，Invent 打造了柱式法亚细胞结构分离平台，配有全套的动植物亚细胞结构分离工具，可分离内质网，高尔基体，溶酶体，线粒体，内体，细胞膜，叶绿体，外泌体，微粒体，细胞核等，仅需极少的样品，无需超高速离心，即可获得高质量的亚细胞结构。

 

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