2025.06.26【微生物】|QIIME2分析ONT扩增子数据的标准流程

穆易青

于 2025-06-26 14:18:51 发布

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分类专栏：扩增子细菌三代文章标签：数据分析 python r语言

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随着Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序平台的普及，越来越多的微生物多样性研究采用全长16S等扩增子进行高通量测序。QIIME2作为主流的微生物组数据分析平台，虽然DADA2不支持ONT数据，但通过vsearch聚类等方法，依然可以高效完成ONT扩增子数据的分析。本文以多样本分析为例，详细介绍如何用QIIME2处理ONT扩增子数据。

一、准备工作

1. 安装QIIME2

建议使用conda环境安装，具体可参考QIIME2官方文档。
确保已安装vsearch、feature-classifier等常用插件。

2. 准备数据和配置文件

fastq文件：每个样本一个fastq，建议已完成basecalling和初步质控。
manifest文件：记录样本名和fastq绝对路径，csv格式。
metadata文件：样本分组信息，tab分隔。

manifest文件示例（all_sample_manifest.csv）：

sample-id,absolute-filepath
FPSYSG_1_LXBR,/path/to/FPSYSG_1_LXBR.fastq
FPSYSG_2_LXBS,/path/to/FPSYSG_2_LXBS.fastq
...

metadata文件示例（sample-metadata.txt）：

sample-id	group
FPSYSG_1_LXBR	FPSYSG_1_LXBR
FPSYSG_2_LXBS	FPSYSG_2_LXBS
...

二、QIIME2分析流程

1. 数据导入

将fastq数据导入为QIIME2的artifact格式（.qza）：

qiime tools import \
  --type 'SampleData[SequencesWithQuality]' \
  --input-path all_sample_manifest.csv \
  --output-path demux.qza \
  --input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2

2. 去冗余（dereplication）

qiime vsearch dereplicate-sequences \
  --i-sequences demux.qza \
  --o-dereplicated-table table.qza \
  --o-dereplicated-sequences rep-seqs.qza

3. OTU聚类（97%相似度）

qiime vsearch cluster-features-de-novo \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --p-perc-identity 0.97 \
  --o-clustered-table table-97.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-97.qza

4. 去嵌合体

qiime vsearch uchime-denovo \
  --i-table table-97.qza \
  --i-sequences rep-seqs-97.qza \
  --o-chimeras chimeras.qza \
  --o-nonchimeras nonchimeras.qza \
  --o-stats chimera-stats.qza

5. 物种注释

假设你有训练好的全长16S分类器（如SILVA）：

qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier silva-138-99-classifier.qza \
  --i-reads rep-seqs-97.qza \
  --o-classification taxonomy.qza

6. 结果可视化

qiime taxa barplot \
  --i-table table-97.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.txt \
  --o-visualization taxa-bar-plots.qzv

7. 多样性分析（可选）

qiime diversity core-metrics \
  --i-table table-97.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.txt \
  --output-dir core-metrics-results

三、注意事项与建议

manifest文件必须为csv格式，且路径为绝对路径。
metadata文件需为tab分隔，首行为sample-id。
ONT数据建议先用NanoFilt等工具进行长度和质量过滤。
物种注释建议用全长16S数据库（如SILVA全长）。
如需ASV级别分析，推荐NanoCLUST、Emu等专用工具。

四、总结

通过上述流程，QIIME2可高效完成ONT扩增子数据的多样本分析，包括OTU聚类、去嵌合体、物种注释和多样性分析。只需准备好manifest和metadata文件，按流程执行即可获得高质量的微生物群落结构分析结果。

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