褪黑素通过促进 SERCA2 相关的细胞内钙稳态保护 RPE 细胞免于坏死性凋亡和 NLRP3 激活

据最新研究预测，到 2040 年全球受 AMD 影响的人数将达到 2.88 亿。作为一种多因素疾病，AMD 的主要特征是视网膜色素上皮（RPE）细胞的退化以及由此引发的光感受器继发性死亡。尽管 AMD 的发病机制复杂，涉及多种病理过程，但 RPE 细胞死亡、氧化应激和炎症反应被认为是其中最关键的环节。

褪黑素（N - 乙酰 - 5 - 甲氧基色胺）是一种在植物、动物、藻类和细菌中广泛存在的天然分子，在人体中主要由松果体以昼夜节律方式合成，并通过视网膜 - 下丘脑通路调节，直接释放到血液中并分布到所有组织。由于其抗炎、抗氧化和抗凋亡功能，褪黑素在多种与环境应激相关的疾病中显示出潜在的应用价值，尤其是在 AMD 的研究中。已有研究证实，褪黑素可保护 RPE 细胞免受过氧化氢引起的细胞死亡，在非渗出性 AMD 模型和 SI 诱导的视网膜变性小鼠模型中均表现出保护作用。然而，褪黑素在 RPE 细胞保护中的具体靶点和分子机制仍有待深入探究。​

钠碘酸盐（SI）作为一种常用的化学试剂，被广泛用于构建模拟地理萎缩（GA）的实验模型，该模型主要特征包括 RPE 细胞死亡和视网膜下炎症。已有研究表明，SI 可诱导 RPE 细胞发生多种类型的死亡，如坏死性凋亡和 ferroptosis，且这些细胞死亡类型之间可能存在相互作用。此外，SI 还可通过招募巨噬细胞到损伤部位发挥促炎作用，但具体机制尚未完全阐明。因此，深入研究 SI 诱导的 RPE 细胞死亡和炎症反应机制，对于理解 AMD 的发病机制以及探索潜在的干预靶点具有重要意义。​

本研究采用体内和体外相结合的实验方法，系统探讨了褪黑素对 SI 诱导的 RPE 细胞损伤的保护作用及其分子机制。在体内实验中，选用 6-8 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠，小鼠饲养在无病原体环境中，温度恒定在 22°C，光暗周期为 12 小时，自由摄食和饮水。SI 溶解于无菌生理盐水，浓度为 1mg/ml，单次腹腔注射给药；褪黑素溶解于含 10% 乙醇的无菌生理盐水，浓度为 8mg/ml。实验分为 5 组：褪黑素 20mg/kg 组、40mg/kg 组、80mg/kg 组、SI 组和对照组，褪黑素组小鼠每天腹腔注射相应剂量的褪黑素，SI 组和对照组注射等量溶媒，24 小时后分别给予 30mg/kg SI 和无菌生理盐水。通过视网膜组织学分析、视网膜功能评估等方法，研究褪黑素对小鼠视网膜结构和视觉功能的影响。​

体外实验采用 RPE 细胞系 ARPE-19，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、100U/ml 青霉素和 100mg/ml 链霉素的 DMEM/F12 培养基，在 37°C、5% CO₂培养箱中培养。根据实验需求，将细胞接种于 6 孔、12 孔、24 孔或 96 孔板，待细胞贴壁后进行相应处理。对于坏死性凋亡和细胞内钙相关实验，RPE 细胞在 SI 处理前 48 小时用 200nM 褪黑素预处理；对于 NLRP3 炎症小体相关实验，细胞经相同预处理后，先用 5μg/ml LPS priming 3 小时，再用 SI 处理 4 小时。​

细胞活力通过 CCK-8 试剂盒检测，酶标仪读取吸光度。PI 染色和 Annexin V-FITC/PI 双染色用于评估细胞死亡和凋亡率，PI 染色后通过荧光显微镜观察并计数 PI 阳性细胞，Annexin V-FITC/PI 双染色通过流式细胞仪检测。蛋白质水平通过 Western blot 分析，细胞经预冷 PBS 洗涤后，用含蛋白酶抑制剂、NaF、Na₃VO₄和 PMSF 的 RIPA 缓冲液裂解，提取总蛋白，经 BCA 法定量后，取 30μg 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，随后转移至硝酸纤维素膜，用 5% 脱脂奶粉封闭后，与一抗 4°C 孵育过夜，再与相应二抗室温孵育 1 小时，最后用 Odyssey 成像系统扫描蛋白条带，并用 Image Studio 软件分析条带强度。​

免疫荧光实验中，细胞经 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，0.1% Triton X-100 透化后，用 5% BSA 封闭 1 小时，随后与一抗 4°C 孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育 1 小时，DAPI 染色后，用 Leica 荧光显微镜或 Zeiss LSM 980 Airyscan SR 显微镜成像。细胞内 ROS 水平通过 H2DCFDA 探针检测，线粒体超氧化物通过 Mitosox 染色评估，细胞内钙和线粒体钙水平分别用 Fluo-4AM 和 Rhod-2AM 染色，经荧光显微镜或流式细胞仪检测。线粒体功能评估包括线粒体膜电位（用 TMRE 染色）、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放（用 Calcein-AM 和钴 chloride 染色）以及线粒体动态变化（通过 Tom20 免疫荧光观察）。​

实验结果显示，SI 处理可诱导 RPE 细胞死亡，且呈时间依赖性，同时伴随 ROS 大量积累，1 小时处理后约 40% 细胞为 ROS 阳性，4 小时后接近 100%。PI/Annexin V 染色表明 SI 主要诱导坏死性凋亡，表现为 PI/Annexin V 双阳性细胞增加，而凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl-2 水平无明显变化，RIPK3 蛋白水平显著升高且出现胞质聚集，提示坏死小体形成。此外，SI 可激活 NLRP3 炎症小体，在 LPS priming 后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的蛋白水平显著上调。​

褪黑素预处理可显著减轻 SI 诱导的 RPE 细胞损伤，200nM 和 200μM 褪黑素可提高细胞活力，其中 200nM 浓度被选为后续实验浓度。敲除 MT2 受体（siMT2）可逆转褪黑素的保护作用，降低细胞活力，增加 PI 阳性细胞比例，同时使 RIPK3 水平回升，NLRP3 炎症小体相关蛋白表达上调，表明褪黑素的保护作用主要通过 MT2 受体介导。

体内实验中，褪黑素预处理（20、40、80mg/kg）可剂量依赖性地保护小鼠视网膜结构，维持外核层（ONL）厚度，其中 40 和 80mg/kg 剂量可在 SI 处理后 3 天仍保持视网膜结构完整性，同时保留 RPE 的正常结构和视觉功能（通过视网膜电图 ERG 评估），Western blot 分析证实褪黑素可抑制小鼠 RPE - 脉络膜复合体中 RIPK3 和 NLRP3 炎症小体相关蛋白的表达。​

进一步研究发现，褪黑素可降低 SI 诱导的细胞内 ROS 和线粒体超氧化物水平，但抗氧化剂 NAC 虽能抑制 NLRP3 炎症小体激活，却对 RIPK3 水平和细胞活力无明显影响，而线粒体靶向抗氧化剂 Mitotempo 反而加剧 SI 诱导的细胞损伤，提示抗氧化作用并非褪黑素保护 RPE 细胞的主要机制。通过对 GSE142591 数据集的 GSEA 分析发现，SI 处理显著富集钙相关信号通路，实验证实 SI 可诱导 RPE 细胞内钙超载，而褪黑素可通过 MT2 受体减轻这种超载。使用 EGTA（细胞外钙螯合剂）或 BAPTA-AM（细胞内钙螯合剂）可降低细胞内钙水平并提高 SI 处理后的细胞活力，表明钙超载在 SI 诱导的 RPE 损伤中起关键作用。​

内质网（ER）作为细胞内主要的钙储存库，其应激与钙稳态失衡密切相关。GSEA 分析显示 SI 处理富集 ER 相关通路，Western blot 结果表明 SI 可激活 PERK/eIF2α/ATF4 ER 应激通路，而褪黑素可通过 MT2 受体抑制该通路激活。ER 应激抑制剂 4PBA 可降低 SI 诱导的细胞内钙超载，提高细胞活力，同时减少 RIPK3 和 NLRP3 炎症小体相关蛋白的表达，提示 ER 应激参与了 SI 诱导的 RPE 坏死性凋亡和炎症反应。​

线粒体作为钙缓冲器，可从 ER 摄取钙，SI 处理导致线粒体钙水平升高，线粒体膜电位降低，mPTP 开放增加，而褪黑素可通过 MT2 受体减轻这些线粒体功能异常。抑制 mPTP 开放的环孢素 A（CsA）反而加剧 SI 诱导的细胞死亡，可能与线粒体钙超载和线粒体分裂增加有关。使用线粒体分裂抑制剂 Mdivi-1（购自 AbMole 公司）可显著改善 SI 诱导的细胞活力下降，且不影响线粒体钙水平，表明线粒体分裂是线粒体钙超载下游介导坏死性凋亡的关键事件，免疫荧光显示褪黑素可维持线粒体正常形态，减少 SI 诱导的线粒体碎片化。​

机制研究发现，SI 处理可降低 SERCA2（内质网钙 ATP 酶 2）的 mRNA 水平，而褪黑素可恢复其表达。敲除 SERCA2（siSERCA2）可逆转褪黑素对 SI 诱导的细胞内钙超载、ER 应激、线粒体功能异常和坏死性凋亡的保护作用，同时使褪黑素无法恢复线粒体膜电位和维持线粒体形态。此外，SI 处理降低线粒体转录因子 TFAM 和 TFB2M 的 mRNA 水平，而褪黑素可恢复 TFAM 的表达，提示 TFAM 可能通过促进 SERCA2 转录参与褪黑素的保护作用。​

综上所述，本研究证实 SI 主要通过诱导 RPE 细胞坏死性凋亡和 NLRP3 炎症小体激活导致细胞损伤，而褪黑素通过 MT2/SERCA2 轴维持 ER - 线粒体钙稳态，抑制 ER 应激和线粒体分裂，从而保护 RPE 细胞免受 SI 诱导的损伤。这一发现揭示了褪黑素在 AMD 中的潜在应用价值，并阐明了其通过调节钙信号通路发挥保护作用的分子机制，为 AMD 的研究提供了新的靶点和思路。