外泌体锚定导电水凝胶恢复心肌梗死-缺血再灌注后的心脏功能

过去 20 年，基于干细胞的再生疗法在心脏修复领域逐渐兴起。间充质干细胞（MSCs）因其自我更新、多向分化、丰富的自分泌和旁分泌功能以及众多正在进行的临床应用而展现出诸多优势。与其他来源相比，人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）具有易于分离获取、无伦理问题、低免疫原性以及便于规模化生物制药生产等独特优势，成为心肌工程中最具前景的候选者。然而，直接注射的 MSCs 存在细胞植入率低、留存时间短、存活率低等问题。

外泌体（Exo）是细胞分泌的纳米级膜结合 extracellular 囊泡，可介导细胞质 cargo 的细胞间运输。干细胞来源的外泌体富含多种功能蛋白和细胞因子，具有与亲代细胞相当的心脏保护能力。此外，基于外泌体的 “无细胞” 治疗策略可有效避免干细胞移植的潜在致瘤性和免疫原性，且易于按生物制药标准生产。但外泌体在器官中的半衰期较短（70-80 分钟），全身给药易被吞噬细胞快速清除，并优先在肺、脾、肝等单核吞噬细胞系统器官积累，导致不可控的副作用和生物安全隐患。另一方面，多次心肌内注射外泌体的手术操作繁琐耗时，这些障碍严重限制了外泌体制剂的临床应用。众多研究表明，基于水凝胶的外泌体递送可有效延长外泌体的留存时间并提高局部利用率。最近发现，CP05 肽（CRHSQMTVTSRL，AbMole，M58139）能够与外泌体表面富集的四跨膜蛋白 CD63 的第二个胞外环结合，从而锚定和捕获外泌体，提高外泌体在靶器官中的稳定性。本研究基于此，设计了一种嵌入 CP05 肽的水凝胶来锚定外泌体，以提高外泌体的留存率。

CP05 | AbMole | CRHSQMTVTSRL

心肌梗死 - 缺血 / 再灌注（MI-I/R）后，坏死心肌细胞间通过连接蛋白 43（Cx43）的细胞间通讯受限，中断了孤立心肌组织间的电生理传导，影响心脏同步收缩，导致心律失常。具有导电活性的功能性水凝胶能够显著改善心肌纤维化区域的电传导，促进心肌同步收缩，减少心律失常。已有研究报道，聚苯胺（PANI）导电水凝胶可恢复心肌梗死区的电脉冲传导，预防心律失常并保护心室功能。作为 PANI 的低聚物，苯胺四聚体（AT）具有优异的电活性和低细胞毒性。在前期研究中，一系列含 AT 的水凝胶被用于组织修复，在受损心肌中显著上调 Cx43 的表达，重建心功能。

为克服外泌体留存时间短和 MI 治疗中潜在心律失常的障碍，本研究精心构建了一种外泌体锚定导电水凝胶。具体而言，采用 AT 修饰超支化环氧聚合物，制备大分子单体（AT-EHBPE）作为交联剂，参与水凝胶网络的构建并赋予其电活性。巯基化透明质酸（HA-SH）作为另一种凝胶前体，是细胞外基质的重要成分，具有显著的生物相容性、保水能力，并通过 CD44 和 HA 介导的细胞运动信号受体发挥促血管生成作用。如示意图所示，通过 “点击” 反应构建了负载巯基化 CP05 肽的可注射导电水凝胶，以锚定 hUC-MSCs 来源的外泌体，针对心肌缺血 / 再灌注损伤的复杂病因发挥作用。

AT-EHBPE/CP05 肽包封外泌体的杂化水凝胶（简称 AT-EHBPE/HA-SH/CP05@Exo）通过混合法制备。通常，将 AT-EHBPE 大分子与外泌体的磷酸盐缓冲液（PBS）悬浮液（2 mg）混合，得到前体溶液 A（最终 AT-EHBPE 负载量为 10 wt%），将 CP05 肽水溶液加入 HA-SH 中制备前体溶液 B（HA-SH 的最终浓度为 1 wt%）。当前体溶液 A 和 B 等体积混合时，水凝胶自发凝胶化。其他类型的水凝胶按相同方法制备。通过瓶倒转法测量各种水凝胶的凝胶时间。使用拉曼光谱仪在 500 范围内用 633 nm 激光束表征水凝胶的化学结构。通过 X 射线衍射光谱表征样品中 AT 的晶格结构，测试角度范围为 4-50°，测试速度为 4°/min，激发电压和电流分别为 20 kV 和 30 mA。使用共聚焦激光扫描显微镜观察水凝胶内外泌体。

在流变仪上进行各种水凝胶样品的动态流变学测量。为尽量减少水凝胶的水分蒸发，在 37°C 下的整个流变学测量过程中使用盖子。为确定线性粘弹性区域，在 0.1% 至 1000% 的应变范围内将频率固定在 1 Hz。基于上述应变扫描测试计算凝胶强度。对于时间扫描测试，频率设定为 5 Hz，应变为 1%。在 1% 应变下，在 0.1 至 20 Hz 的频率范围内进行频率扫描测试。在粘度模式下测试水凝胶的粘性变化，剪切速率从 0.01 到 100 s。在 20% 应变和 5 Hz 频率下进行抗疲劳测试。

采用重量法在 25°C 下测量水凝胶的平衡含水量（EWC）。通常，150 μL 水凝胶样品在超纯水中充分溶胀至平衡。然后取出，用滤纸轻轻擦拭，立即在微量天平上称重。随后，将水凝胶样品在 60°C 的真空烘箱中干燥至恒重。水凝胶的 EWC 定义为 EWC=(mwet - mdry)/mwet × 100%，其中 mwet 表示平衡重量，mdry 表示每个水凝胶样品的干重。

采用重量损失测量来测试水凝胶的降解行为。简而言之，150 μL 水凝胶样品在称量原始质量后，浸入 5 mL PBS 缓冲液中，在 37°C 的摇床中培养。在规定的时间点，取出水凝胶样品，用滤纸轻轻擦拭表面，在微量天平上称重。水凝胶的质量比定义为质量比 =(mo - mp)/mo × 100%，其中 mo 表示原始重量，mp 表示每个水凝胶样品在规定时间点的当前重量。

使用 L929 成纤维细胞和 H9C2 心肌细胞测试水凝胶的细胞相容性。首先，将水凝胶样品浸入 75% 医用乙醇中 12 小时灭菌，然后用过量无菌 PBS 洗涤过夜。将水凝胶样品浸入 DMEM 中 12 小时，将提取物转移到 96 孔板中，与细胞（2×105）共孵育 24 小时。随后，进行 MTT 测定以评估 L929 和 H9C2 的相对细胞活力。

通过典型的差速超速离心法从 hUC-MSCs 中分离外泌体。简而言之，hUC-MSCs 在含有 1% 间充质干细胞生长因子和 1% 青霉素 - 链霉素溶液的特殊培养基中培养。当细胞生长至 80% 汇合时，收集 hUC-MSCs 的培养上清液，用 0.45 μm 过滤器过滤以去除细胞碎片，然后将滤液在 4°C 下分别以 300g 离心 10 分钟、2000g 离心 10 分钟、10,000g 离心 30 分钟和 120,000g 离心 4 小时。获得外泌体，每管用 500 μL PBS 重悬。BCA 法用于定量外泌体的蛋白质含量。通过 western blot 鉴定外泌体的生物标志物（Alix、CD63 和 CD9）。通过 TEM 观察外泌体的形态，外泌体样品的 TEM 测试制备程序遵循负染色方案。通过 DLS 测定外泌体的 zeta 电位。

根据制造商方案，使用 PKH-26 试剂盒（M21701，AbMole）标记外泌体。通常，将外泌体与 100 μM PKH-26 染料溶液（每 100 μg 外泌体 50 μL PKH-26 染料溶液）在 37°C 黑暗环境中孵育 10 分钟。随后，加入 20 mL PBS 终止染色。通过差速离心获得 PKH-26 标记的外泌体，用 500 μL PBS 重悬。将 H9C2 心肌细胞在 48 孔板中与标记的外泌体孵育 12 小时。弃去培养上清液，用 PBS 冲洗细胞。用 DAPI 染色 5 分钟后，在荧光显微镜下观察 PKH-26 标记的外泌体的细胞摄取情况。

采用划痕迁移实验评估人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞迁移能力。简而言之，将 HASMCs 和 HUVECs 接种到 12 孔板中，使用 DMEM 培养。当细胞汇合度达到 90% 后，用无菌细胞刮器在细胞单层上制造划痕伤口。将细胞在含有血管内皮生长因子（VEGF，50 ng/mL）或外泌体（20 μg）的 1% 外泌体无血清 DMEM 培养基中再生长 24 小时。与外泌体体积相同的 PBS 作为对照。在 0 和 24 小时在显微镜（IX73，Olympus）上记录迁移距离。

雄性 Sprague-Dawley 大鼠（SD，220±20 g）实验前禁食 12 小时，但允许自由饮水。对于 MI-I/R 模型，通过腹腔注射 5% 三溴乙醇（6 mL/kg）麻醉大鼠，在第四肋间进行开胸以暴露心脏。使用 6-0 丝线结扎左前降支冠状动脉。缺血 1.5 小时后，移除缝线进行再灌注。对于所有动物实验组，再灌注后在左心室缺血病变区域的三个部位共注射 75 μL 各种物质。

为评估外泌体在体内的留存情况，将包封 150 μg PKH-26 标记外泌体的 EHBPE/HA-SH 和 EHBPE/HA-SH/CP05 水凝胶心肌内注射到再灌注后的大鼠心脏中。作为对照，心肌内注射 75 μL 含有 150 μg PKH-26 标记外泌体的 PBS。在注射后 3、7 和 14 天，通过体内成像系统在 550-570 nm 处扫描收获的大鼠心脏。

所有 SD 大鼠随机分为七组：（I）假手术组，（II）MI-I/R 模型组（PBS），（III）游离外泌体组（PBS / 外泌体），（IV）EHBPE/HA-SH 组（EHBPE/HA-SH 水凝胶），（V）AT-EHBPE/HA-SH 组（AT-EHBPE/HA-SH 水凝胶），（VI）AT-EHBPE/HA-SH@外泌体组（AT-EHBPE/HA-SH 水凝胶 / 外泌体），以及（VII）AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（AT-EHBPE/HA-SH 水凝胶 / 外泌体 / CP05 肽）。

在预定时间点，使用超高分辨率动物超声成像系统评估左心室功能。测量以下八个参数作为心功能指标：射血分数（EF）、缩短分数（FS）、舒张期室间隔（IvS;d）、收缩期室间隔（IVS;s）、舒张期左心室内径（LVID;d）、收缩期左心室内径（LVID;s）、舒张期左心室后壁（LVPW;d）和收缩期左心室后壁（LVPW;s）。

大鼠在再灌注后 28 天安乐死。所有心脏在固定前均置于心脏停搏液中，以确保所有心脏处于放松状态。对于组织学分析，心脏用 4% 甲醛溶液固定 7 天。随后，将脱水的组织包埋在石蜡中，切成 5 μm 切片，进行 Masson 三色染色、苏木精 - 伊红（H&E）染色和天狼星红染色。对于免疫荧光（IF）染色，切片用 1% Triton X-100 透化 5 分钟。用 PBS 洗涤后，切片在 2% BSA 的 PBS 中封闭。为修复抗原，使用柠檬酸缓冲液和微波处理。然后，将切片与一抗在 4°C 下孵育 12 小时。用 PBS 洗涤三次后，将切片与对应一抗的二抗（1:200）在 37°C 下孵育 1 小时。用 PBS 冲洗后，切片用 DAPI 复染。对于免疫染色评估，每组至少分析三只大鼠。每张切片至少分析三个视野。使用荧光显微镜和数码相机检查切片。使用 ImageJ 软件量化免疫荧光密度。

本研究中所有数据均以均值 ± 标准差（SD，至少 n=3）表示。通过方差分析（ANOVA，SPSS 17.0）进行统计分析，然后通过最小显著差异（LSD）检验或 Dunnett t 检验进行多重比较。p<0.05 被认为具有统计学意义。

导电 AT 因其良好的导电性和低细胞毒性而广泛用于生物医学应用。本研究中，采用 AT 赋予所设计的水凝胶导电性。如图 S1 所示，通过 ¹H NMR 证实 AT 的成功合成。6.8-7.3 ppm 处的峰归属于苯环的质子，5.6 ppm 处的峰归属于 - NH₂的质子。AT 的质谱显示 AT 的分子量为 366，与理论质均分子量（366.4）一致。超支化聚合物是具有三维树枝状结构的高度支化大分子。它们的球状和树枝状结构表现出独特的性质，如丰富的官能团和良好的溶解性。因此，具有丰富端基的超支化聚合物作为可注射水凝胶显示出更大的前景。本研究中，通过 “A2 + B4” 动态可控方式的氨基和环氧基之间的热固化合成了一种新型超支化 EHBPE 大分子单体，如图 2A 所示。通常，“A2 + B4” 逐步聚合是传统上被认为直接形成交联凝胶的方法。如图 S2 所示，在 50°C 反应 4 小时后，在不同摩尔比（环氧基 / 氨基 - H）下，反应溶液在小瓶中可以处于未凝固的澄清液体状态或凝胶状态。然而，当等环氧基 / 氨基 - H 摩尔比的相关纯化产物在室温下储存 2 小时时完全交联，而其他进料比的 EHBPE 聚合物产物是透明粘性流体，没有完全固化。考虑到聚合物的状态和 “ A2 + B4 ” 逐步聚合的产率，选择 1.2:1 的摩尔比进行进一步研究。温度、溶剂条件和反应时间对调节聚合动力学至关重要。实验结果表明，随着温度（70 和 80°C）的升高，反应混合物逐渐交联，在没有溶剂的情况下，在 50°C 下反应 4 小时也会交联。此外，反应溶液在 50°C 下在小瓶中 7 小时可容易固化。此外，如图 S3 和 S4 所示，通过 ¹H NMR 和 FTIR 分析不同合成条件下 EHBPE 的化学结构和形成，证明了 EHBPE 的成功合成（详细信息可在支持信息中找到）。选择以下 “ A2 + B4 ” 环氧 / 氨基逐步聚合的最终反应参数：摩尔比 1.2:1，50°C，EtOH 作为溶剂，反应时间 4 小时，以可控方式完成 “ A2 + B4 ” 逐步聚合。

第二步，将 AT 接枝到 EHBPE 主链上以获得导电 AT-EHBPE 大分子单体。如图 S5 所示，与 EHBPE 相比，6.5-7.5 ppm 处的峰归属于 AT 的苯环质子。AT-EHBPE 大分子单体的残留环氧基（环氧值 = 0.11 表 S5）提供了与其他官能团反应的开放位点，以促进水凝胶的固化。根据环氧值的变化，计算 AT 的接枝率为 10.9 wt%。通过 FT-IR 分析 AT-EHBPE 的化学组成。如图 2B 所示，在 EHBPE 和 AT-EHBPE 的光谱中可以观察到以 3386 cm⁻¹ 为中心的宽信号，属于新形成的羟基。AT-EHBPE 的醚键和环氧基的伸缩振动明显出现在 1106、946 和 846 cm⁻¹ 处。此外，AT 的苯环的骨架振动位于 1506 cm⁻¹ 处，表明 AT-EHBPE 的成功合成（FT-IR 光谱中吸收的详细归属列于表 S6）。此外，由于 AT 链之间的强疏水相互作用，AT-EHBPE 能够在水溶液中自组装成球形颗粒（图 2A）。在 TEM 下可以明显观察到以 AT 为疏水核和 EHBPE 为亲水壳的自组装 AT-EHBPE 纳米颗粒（NP）的形态（图 2C）。通过动态光散射（DLS）测量 NP 的尺寸为 250 nm（图 2D）。

通过 AT-EHBPE、巯基化透明质酸（HA-SH）和巯基化 CP05 的环氧 / 巯基 “点击” 反应制备可注射水凝胶。AT-EHBPE 参与交联网络的构建并赋予所得水凝胶电活性，CP05 肽提供外泌体锚定能力以促进外泌体的高效包封（图 1）。具有丰富环氧基的超支化大分子单体为在环境条件下与 HA-SH 快速凝胶化铺平了道路（图 3A）。两种前体的可控原位凝胶行为使水凝胶具有优异的可注射性，这将极大地方便实际中的手术操作（图 3B）。通过瓶倒转法检查各种水凝胶的凝胶时间（图 S6）。如图 3C 所示，所得水凝胶可在 110 s 内稳定固化，并且各种样品之间的凝胶时间没有显著差异。适当的凝胶时间对于可注射水凝胶在生物体中的应用至关重要。在从溶液到完全凝胶的转变过程中，水凝胶可以保持其粘度和可注射性能，而不会从注射部位泄漏，这为所设计水凝胶的体内给药提供了极大的便利。

通过应变扫描和频率扫描测试评估所得水凝胶在动态条件下的稳定性。四种类型的水凝胶在广泛的应变和频率范围内表现非常稳定，特别是在大鼠心脏变形范围（10-20%，图 3D）和大鼠心跳频率（5 Hz，图 3E）范围内。此外，负载外泌体的水凝胶（AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体）的凝胶强度为 120 Pa，并且在抗疲劳测量中，水凝胶在 100,000 次循环后仍能保持稳定（图 3F），表明所得的 Gel@外泌体能够适应心肌动态环境。如图 3G 所示，所制备的水凝胶的粘度随着剪切速率的增加而显著下降，预示着典型的剪切稀化行为，为注射提供了便利。

水凝胶的含水性能对于模拟细胞外基质（ECM）的生理环境和细胞或细胞分泌物的负载能力具有重要意义。所有水凝胶的 EWC 均超过 90%，可以满足原生心肌的含水条件（图 S7）。此外，作为一种天然粘多糖和 ECM 的重要组成部分，HA 可以在体内生理条件下被酶完全生物降解。水凝胶在第一天损失约 40% 的质量。质量损失速率减慢，在 PBS 中 9 天的时间内，水凝胶质量保持在其原始质量的 40%（图 3H）。在我们之前的研究中，进行皮下植入以检查 HP-PEG/HA-SH 水凝胶的体内降解曲线。水凝胶在植入后的前 3 天表现出肿胀，达到原始重量的约 120%，然后开始减重。在植入后 21 天，仍有 90% 的原始水凝胶残留。本研究中，制备了具有环氧端基的升级超支化 PEG 大分子单体制备可注射水凝胶，所得水凝胶的交联三维（3D）网络与 HP-PEG/HA-SH 相似，预示着体内相似的降解曲线。

H9C2 和 L929 与各种水凝胶的提取物共孵育 24 小时后，相对细胞活力均超过 90%，表明其细胞毒性可忽略不计且具有优异的细胞相容性（图 S8）。

MI-I/R 后大量心肌细胞（CMs）死亡将急剧延迟瘢痕区域的电传导。据报道，导电生物材料通过重新连接孤立的原生心肌，具有改善心脏同步收缩的作用。如图 4A 所示，在 AT 的 UV-vis 光谱上，在 430 nm 附近出现极化子的特征吸收，这归因于 AT 骨架的长程共轭。在 EHBPE 的宽 UV 波段中未观察到吸收，而在 HCl 掺杂的 AT-EHBPE 大分子单体的情况下，在 438 nm 处可观察到新形成的 UV 吸收，表明 AT-EHBPE 的电活性归因于 AT。

XRD 中 AT 的衍射峰（2θ=19.7 和 21.0）（图 4B）和 AT 的特征拉曼信号（1167、1340 和 1603 cm⁻¹ 图 4C）可以在 AT-EHBPE 和含 AT-EHBPE 的水凝胶的相关光谱中观察到，揭示了携带 AT 的结构。

本研究中，通过 AT-EHBPE 和 HA-SH 的共价交联制备导电水凝胶。HA-SH 能够完成 AT-EHBPE 的酸掺杂，赋予凝胶高电活性。通过四探针法和 CV 测量均证实了含 AT 的水凝胶的优异导电性。导电材料的电容与 CV 曲线的封闭面积呈正相关。与 AT 相比，AT-EHBPE/HA-SH 水凝胶也表现出大的封闭面积，预示着高电容（图 4D）。如图 4E 所示，水凝胶的导电性增强归因于 AT-EHBPE 含量的增加。AT-EHBPE（5%）/HA-SH 水凝胶具有最高的电导率（G=6.3×10⁻⁴ S/cm³），与原生心肌的电生理导率（从 5×10⁻⁵到 1.6×10⁻³ S/cm³）一致，表明这种水凝胶可能适合恢复受损心肌的心脏电传导。采用 AT-EHBPE（5%）/HA-SH 水凝胶进行进一步研究。同时，如图 4F 所示，建立了带有多色 LED 装置的外部电路，以直观展示导电水凝胶的电活性。与非导电水凝胶相比，导电 AT-EHBPE/HA-SH 水凝胶作为 “开关” 使 LED 装置发出多色光（图 4G-H）。

在 TEM 中观察到，外泌体是具有边界膜的杯状纳米囊泡，其直径约为 60 nm（图 5A）。外泌体的 western blot 分析表明，外泌体的生物标志物如 Alix、CD63 和 CD9 在外泌体表面充分表达（图 5B）。如图 5C 所示，PKH-26 标记的外泌体逐渐被 HUVECs 内化（细胞核用 DAPI 染色）。为了研究外泌体对 HASMCs 和 HUVECs 的作用，采用划痕迁移实验评估细胞迁移能力。与外泌体孵育 24 小时后，HASMCs 和 HUVECs 的相对细胞迁移能力比与 DMEM 孵育的显著增强。在外泌体和 VEGF 对 HASMCs 的作用之间没有观察到显著差异，而 VEGF 比外泌体更能促进 HUVECs 的迁移能力（图 5D-E）。这些结果表明，从 hUC-MSCs 中成功分离出外泌体，所得外泌体可能具有促血管生成潜力。

如图 S9 所示，通过 zeta 电位测量评估 AT-EHBPE NPs 带有正电荷，这可以通过静电相互作用与带负电荷的外泌体结合。在 CLSM 下观察水凝胶内外泌体的分布。如图 5F 所示，标记的外泌体分布在整个水凝胶中。为了测试所得水凝胶在延长体内外泌体留存方面的作用，在心肌内给药后 3、7 和 14 天，通过 IVIS 检测 PKH-26 标记的外泌体的荧光强度（FI）。如图 6 所示，在 3 天时，EHBPE/HA-SH@外泌体组（1.5×10⁸）和 EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（1.9×10⁸）的 FI 值显著高于游离外泌体对照组（2.6×10⁷）。外泌体的荧光随时间逐渐减弱，表明注射的外泌体被逐渐清除和内吞。在给药后第 7 天，游离外泌体的 FI 降至 8.4×10⁶，显著低于 EHBPE/HA-SH@外泌体组（5.5×10⁷）和 EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（8.7×10⁷）。在 14 天时，游离外泌体组未检测到荧光，而 EHBPE/HA-SH@外泌体组（9.0×10⁶）和 EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（1.8×10⁷）仍可观察到 FI。在 14 天的测量期间，EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组的 FI 高于 EHBPE/HA-SH@外泌体组，表明含 CP05 肽的水凝胶能够显著延长外泌体的留存时间。

据报道，由于缺乏机械支持，直接心肌内注射后 3 小时内外泌体大部分被冲洗掉，并容易被浸润的巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞清除，再灌注情况下这种情况可能更严重。此外，注射器的剪切力可能损害外泌体膜的完整性，直接给药外泌体可能发生外泌体从注射部位泄漏，导致有效治疗剂量不足。为了维持外泌体的长期治疗功能，多次给药外泌体成为克服这一问题的唯一选择，但这种耗时且昂贵的策略对于已经患有心肌损伤的患者来说，由于额外的手术操作和二次创伤风险，在临床实践中可能不太可行。基于这一事实，人们努力探索更有效的外泌体递送方法，以延长外泌体的留存时间并提高局部利用率，这有助于为脆弱患者提供更高效、更经济的选择。大量新兴研究表明，通过三维水凝胶支架心肌内递送外泌体是一种更好的策略。水凝胶为外泌体提供理想的粘弹性基质，保护它们不被清除，并避免在缺血病变中快速丢失。这些高含水量的软生物材料可以模拟 ECM 的环境来负载外泌体，外泌体能够从互连通道移动并通过基于凝胶的限制到达靶位点。包封在天然或半合成水凝胶中的外泌体，如 HA 水凝胶、海藻酸钠水凝胶、胶原蛋白制备的贴片、脲基 - 嘧啶酮偶联的聚乙二醇水凝胶以及普朗尼克 F127 / 支链淀粉水凝胶，在体内表现出外泌体留存增强。已有研究表明，CP05 肽通过与外泌体表面的生物标志物 CD63 四跨膜蛋白特异性结合，具有外泌体锚定特性，这将促进外泌体在水凝胶中的负载，并提高外泌体在梗死心肌中的稳定性和生物利用度。体内外泌体留存结果证明，所设计的生物活性水凝胶可以作为心肌内递送外泌体的优化策略。

在对所制备的水凝胶进行详细的物理化学评估后，建立 SD 大鼠的 MI-I/R 模型，以研究各种水凝胶的治疗作用（图 7A）。SD 大鼠被随机分配到七组，接受不同的处理（图 7B）。在水凝胶给药后 3、7、14 和 28 天，通过超声心动图（ECHO）评估心功能（图 7C）。

再灌注后 3 天，与正常大鼠心脏（I）相比，其他 MI-I/R 实验组（II-VII）的 EF 值从 74% 急剧下降至约 51%（II）（图 7D）。如图 7E 所示，FS 值从 45% 显著下降至约 27%（II），表明 MI-I/R 模型成功建立。在各种治疗组（III-VII）中，随着时间的推移，EF 和 FS 均有显著改善。值得注意的是，与游离外泌体（III）相比，单独水凝胶治疗组（IV 和 V）在 28 天时的心脏 EF 和 FS 进一步增强，表明所得水凝胶的心脏保护作用归因于导电性和基于 HA 的生物功效（图 7D、E 和表 S7）。此外，负载外泌体的水凝胶（VI 和 VII）在促进 EF（VI：49.6±8.3%，VII：51.4±8.9%）和 FS（VI：26.3±5.0%，VII：27.3±5.9%）方面比不含外泌体的水凝胶组表现更好（表 S7），表明导电水凝胶和外泌体在恢复心功能方面具有协同作用。

HA 是一种促血管生成大分子，通过 HA 介导的细胞迁移信号通路引发一系列细胞事件，包括内皮细胞的增殖、迁移和管形成。由于携带 AT 的结构，所制备的具有与原生心肌匹配的导电性的水凝胶将作为桥梁连接孤立的非瘢痕心肌，促进心肌细胞间电生理冲动的传导。此外，基于干细胞的外泌体的 “无细胞” 疗法已被广泛探索作为心肌损伤治疗的有效策略，可改善心脏微环境并促进新血管形成，以再生受损心脏。此外，负载外泌体的水凝胶可以以持续释放的方式递送外泌体，并提高外泌体的留存率，特别是在含 CP05 肽的治疗组（VII）中，生物活性水凝胶基质和药物外泌体的协同作用可能在恢复心功能方面提供更好的生物学效果。

此外，心脏几何相关参数，如 IVS;d、IVS;s、LVPWd 和 LVPW;s 在 AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体给药（VII）后显著改善；在相同治疗方法（VII）下，LVID;d 和 LVID;s 显著缓解（图 S10 和表 S7）。综上所述，上述结果表明可注射导电水凝胶能够重建心脏功能和几何结构。同样，当外泌体和外泌体锚定 CP05 肽都嵌入所得的生物活性水凝胶中时，治疗效果显著增强。

MI-I/R 后，纤维化心肌的弹性和顺应性被瘢痕组织取代，限制电信号传导，导致心功能障碍。改善电传导和促进血管生成对于抑制左心室重构和恢复心功能至关重要。在各种处理后 28 天进行组织学分析，以评估心脏结构的恢复情况。Masson 三色染色显示，MI-I/R 模型（II）的胶原蛋白（蓝色）沉积明显，预示受损心肌组织中存在严重的心脏纤维化（图 8A）。与 MI-I/R（II）和游离外泌体组（III）相比，所有水凝胶治疗组（IV-VII）均显著减轻了受损心脏的纤维化，在 AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（VII）中观察到最佳的再生效果，纤维化面积最小（10.5±4.4%），这可能归因于具有适当电活性的水凝胶基质和 hUC-MSCs - 外泌体的促血管生成功能（图 8B）。同时，在 MI-I/R 大鼠（II）中观察到比正常大鼠心脏（2.4±0.5 mm）薄得多的左心室壁（1.2±0.2 mm），通过导电 Gel@外泌体给药后显著恢复（VI：2.2±0.5 mm 和 VII：2.4±0.4 mm）（图 8C）。在偏振光显微镜下，天狼星红染色的胶原蛋白沉积情况（I 型胶原蛋白被染成红色，而 III 型胶原蛋白呈现绿色）与 Masson 三色染色结果一致（图 8A，D）。此外，H&E 染色显示 MI-I/R 大鼠心肌组织中有大量炎症细胞涌入梗死区域，而所有水凝胶治疗组（IV-VII）均抑制了大多数炎症细胞向梗死区域的浸润，表明所制备的水凝胶具有良好的生物相容性。同时，AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（VII）显示出最佳的抗炎效果。H&E 染色还显示，MI-I/R 大鼠心脏中细胞间隙增大，ECM 成分快速降解，而在负载外泌体的水凝胶组（VI 和 VII）中细胞间隙变紧（图 8A）。这些组织学染色结果证实，负载外泌体的导电水凝胶系统能够通过凝胶和外泌体的有效协同作用抑制不良左心室重构并保留心脏组织纹理。

同时，在心肌内注射后 28 天，从大鼠心肌的 Masson 三色染色切片中看不到水凝胶，表明注射的水凝胶可能在体内完全生物降解。

为了更好地理解 Gel@外泌体系统在分子水平上对 MI-I/R 的心脏保护作用，进行了 IF 染色和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析。Cx43 是细胞间缝隙连接的主要通道，在心肌细胞间电脉冲传导中起着基本作用。与 MI-I/R 模型（II）和游离外泌体组（III）相比，导电水凝胶给药（V-VII）后 Cx43 的水平显著提高，表明如先前研究报道，导电水凝胶可以上调 Cx43 的表达。在 Gel@外泌体复合系统中可以观察到 Cx43 的充分增强极化，这可能归因于导电水凝胶以及 hUC-MSCs - 外泌体对心肌细胞的潜在生物学功能。此外，在 AT-EHBPE/HA-SH/CP05@外泌体组（VII）中，Cx43 以有序的线性斑状极化分布集中在心肌细胞的细胞间区域（图 9A，B）。干细胞来源的外泌体负载丰富的生物活性 cargo，以促进血管生成，受损心肌的新血管形成对于 MI-I/R 后心脏功能的重建至关重要。与 MI-I/R 模型（II）相比，hUC-MSCs - 外泌体可以显著促进 Ki67 的表达，表明促进受损组织中的细胞增殖（图 9C，D）。有趣的是，不含外泌体的水凝胶组（VI 和 V）的 Ki67 水平甚至高于游离外泌体治疗组（III），表明所得水凝胶本身对细胞增殖具有一定的治疗作用，这可能归因于 HA 成分。显然，在所有实验组中，Gel@外泌体组中 Ki67 的表达水平最高，这可能源于含 HA 的水凝胶基质与多功能外泌体的潜在生物学功能相结合，从而更好地促进细胞增殖。如图 9E，F 所示，MI-I/R 后，与原生心肌相比，心脏血管生成相关蛋白 CD31 的表达显著下降，表明血管严重梗死。有趣的是，代表 MI-I/R 模型组小动脉密度的 α-SMA 的分子水平同样略有升高，这可能归因于主动性心脏代偿。游离外泌体治疗（III）对心脏新血管形成的再生作用较弱，而单独水凝胶治疗组（IV 和 V）具有更显著的治疗功能，通过 CD31 和 α-SMA 的更高表达得到证实，表明所得水凝胶具有内在的促血管生成特性。不出所料，导电水凝胶和 hUC-MSCs - 外泌体的协同作用在增强血管和小动脉密度方面优于其他治疗方法，这可以通过 CD31 和 α-SMA 的上调进一步证实，表明所设计的 Gel@外泌体系统在心脏促血管生成方面高度有效。

通过 RT-PCR 测定受损心肌中基因（VEGF-A、VEGF-B、vWF、TGF-β1、MMP-9 和 Serca2a）的表达。如图 10A-C 所示，三种血管生成因子的水平在水凝胶治疗组（IV-VII）中显著上调，特别是在负载外泌体的导电水凝胶（VI 和 VII）中，表明血管生成因子的重要上调能够加速心血管系统和心脏功能的重建。此外，在组（VII）中，纤维化相关基因（TGF-β1 和 MMP-9）的表达急剧下降，表明受损心脏的纤维化显著改善（图 10D，E）。此外，Serca2a 的水平与三种血管生成因子具有相似的变化趋势，预示通过 Gel@外泌体治疗增强心肌收缩力（图 10F）。总体而言，游离外泌体治疗在血管再生方面的治疗益处有限，这可能是由于直接注射的外泌体在梗死心脏中的留存率低且快速丢失。在包封外泌体和 CP05 肽后，具有电活性和外泌体结合作用的 Gel@外泌体系统能够显著上调心脏相关蛋白和血管生成因子的表达，以改善心肌细胞间的电传导并促进受损心脏的细胞增殖和新血管形成，为心脏功能的恢复提供了有前景的平台。

MI-I/R 后，心肌缺血导致大量心肌细胞死亡，随后出现严重的心肌纤维化，丧失细胞间信号传导。恢复受损心肌中的细胞间相互作用和促进新血管形成是改善预后的两个最重要方面。随着生物材料和干细胞技术的快速发展，大量结合干细胞的水凝胶和心脏贴片已被开发用于心肌功能的修复和重建。然而，干细胞在原生心肌中的植入率低、潜在的致瘤性和免疫原性以及药物级干细胞制剂的批次变异性可能阻碍其临床应用。针对上述挑战，构建了一种用于 hUC-MSCs - 外泌体可持续释放的导电可注射水凝胶，以恢复 MI-I/R 后的心脏功能。为了解决心肌梗死区域的电信号传导阻滞问题，将 AT 引入水凝胶系统以构建导电水凝胶。Cx43 蛋白和 Serca2a 的显著上调归因于所得的携带 AT 的水凝胶的导电性。此外，与现成的 Algisyl-LVR 水凝胶相比，本研究中的 HA 水凝胶具有高度的生物活性和完全的生物降解性，因为 HA 作为一种促血管生成大分子已被充分研究。ECHO、组织学分析、IF 染色和 RT-PCR 的结果表明，水凝胶本身可以促进心脏结构和功能的修复，表明所制备的水凝胶的生物学效应。此外，广泛报道称干细胞分泌的外泌体富含丰富的生物活性 mRNA 和功能蛋白，以增强受损心脏的恢复。本研究中，采用在临床实践中具有最大转化潜力的 hUC-MSCs - 外泌体作为心肌修复治疗研究的模型外泌体工具。hUC-MSCs - 外泌体可以被 H9C2 有效内化，并通过体外划痕迁移实验促进 HASMCs 和 HUVECs 的细胞运动性。然而，将外泌体直接注射到大鼠受损心肌中由于在缺血区域的留存率低，对 MI-I/R 心脏的有效恢复具有有限的治疗效果，这也通过动物实验的不良结果得到证实。可注射水凝胶可以通过高含水量的粘弹性基质更有效地心肌内递送外泌体，这有利于外泌体的长期留存。此外，将外泌体锚定 CP05 肽引入这种导电水凝胶中，赋予水凝胶外泌体锚定能力。与游离外泌体和不含肽修饰的 Gel@外泌体相比，含 CP05 肽的 Gel@外泌体组中的外泌体留存时间延长，表明优化的水凝胶复合系统能有效延长外泌体的留存时间。在受损心肌中存在时间更长的外泌体可能对恢复心功能具有持久的治疗作用。动物实验结果表明，具有导电生物利用度的水凝胶与外泌体锚定特性和 hUC-MSCs - 外泌体的协同作用能够通过显著上调心脏相关蛋白和血管生成因子，以最佳方式修复心肌损伤，这将改善细胞间相互作用，促进受损心脏的细胞增殖和血管生成。总之，本研究为缺血性心肌病治疗提供了一个有效的平台。据我们所知，这是首次将导电水凝胶基质与多功能 hUC-MSCs - 外泌体结合，在维持 MI-I/R 后的心脏功能方面发挥 “1+1>2” 的协同作用。作为概念验证，这种导电 Gel@外泌体系统可能是一种具有临床应用转化潜力的有前景的优化策略。

然而，仍存在两个明显的局限性需要注意。首先，尽管如上所述提出了 hUC-MSCs - 外泌体促进 MI-I/R 后心脏功能的可能机制，但准确的信号通路尚未明确阐述。由于缺乏关于 hUC-MSCs - 外泌体的 mRNA 或蛋白质含量的详细信息，本研究尚未挖掘出心脏修复的潜在治疗靶点和有效剂量。另一方面，hUC-MSCs - 外泌体的生物安全性和生物分布尚未经过仔细检查。据报道，外泌体的全身给药将导致外泌体在单核吞噬细胞系统中积累，如肺、脾、肝和胃肠道，引起脱靶效应。通过可注射水凝胶心肌内递送外泌体可能提高外泌体在心脏缺血区域的生物利用度，而从水凝胶释放的外泌体的血液循环和全身生物分布需要进一步研究。其次，水凝胶在梗死心肌中的生物降解行为和代谢途径可能与体外有显著差异，这增加了分离所设计水凝胶各组分（水凝胶、导电性和 hUC-MSCs - 外泌体）的治疗效果的难度。

基于干细胞的再生疗法在治疗心脏损伤方面方兴未艾。然而，四个明显的局限性仍然阻碍着干细胞的临床转化，如潜在的致瘤性、标准化生产困难、留存率低和心律失常风险。为了应对上述挑战，设计了一种锚定 hUC-MSCs - 外泌体的可注射导电水凝胶，以应对 MI-I/R 治疗的严峻困境。采用易于大规模标准化生产的 hUC-MSCs - 外泌体替代干细胞。作为一种无细胞策略，可以最大程度地免除干细胞的潜在致瘤性。水凝胶的电活性有效改善了细胞间相互作用中 Cx43 的极化，从而高度抑制了心律失常的风险。嵌入 CP05 肽的水凝胶基质允许结合外泌体，从而延长 hUC-MSCs - 外泌体的留存时间，改善心脏功能并促进血管再生。导电 Gel@外泌体复合系统可以克服干细胞治疗的四个明显优势，并展示出一种有前景的 MI-I/R 治疗策略。