十溴二苯醚通过炎症衰老导致肠道菌群失调

骨作为一种动态器官，在整个生命周期中通过成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收维持动态平衡，这种平衡的打破是骨质疏松等骨代谢疾病的核心特征。随着人口老龄化加剧，与年龄相关的骨疾病已成为重要的公共卫生问题，因此探究环境污染物 BDE-209 与骨健康之间的关系具有重要的科学价值和现实意义。​

在《Gut microbiota dysbiosis involved in decabromodiphenyl ether-induced bone homeostasis disorder through inflammaging》这项研究中，科研团队采用体内和体外相结合的研究模型，系统探讨了 BDE-209 暴露与骨健康的关联及其潜在机制。在动物实验部分，研究人员选用雌性 SD 大鼠作为研究对象，将 28 只大鼠随机分为四组，分别以 5、50 和 500 mg/kg/ 天的剂量给予 BDE-209 处理，对照组则给予等量的玉米油溶剂，连续处理 60 天。

实验过程中，每日监测大鼠体重，并根据 1 mL/100 g 的安全体重标准调整给药体积，且所有动物实验均经过首都医科大学伦理委员会批准（批准号：AEEI-2022-234）。在处理第 57 天，使用 ZS-ZL 型握力测试仪对大鼠前肢握力进行测定，每只大鼠适应环境 1 小时后重复测量 6 次，计算握力与体重的比值作为评估指标。处理结束后，采用三溴乙醇腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉收集全血，分别置于含促凝剂和分离胶的血清真空采血管以及含 EDTA-K₂的血浆真空采血管中，在 25°C 静置 4 小时后，以 3000 rpm 离心 15 分钟分离血浆和血清。同时，取每只大鼠的单侧肱骨和部分结肠组织用 4% 多聚甲醛固定，其余肱骨和结肠组织则经干冰冷冻后保存于 - 80°C，用于后续各项检测分析。​

对于骨组织的形态学分析，研究团队采用 SkyScan1276 型 Micro-CT 对固定后的肱骨进行扫描，以 8 μm 的分辨率连续成像，并使用配套软件进行三维重建和骨参数分析，包括骨密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）等。随后，对肱骨进行组织病理学评估，先将样本置于 EDTA 脱钙液中，在 25-30°C 的恒温摇床（110-120 rpm）中脱钙，每 2-3 天更换一次脱钙液，直至针头可穿透组织。脱钙后的骨组织经梯度酒精脱水、石蜡包埋，制成 4 μm 厚的切片，分别进行苏木精 - 伊红（HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。HE 染色中，苏木精染色 5 分钟，伊红染色 20 秒，以显示骨组织的整体结构；TRAP 染色则通过 37°C 孵育 2 小时后，加入过滤的 TRAP 染液反应 20 分钟，再经苏木精复染 10 秒，以识别破骨细胞（胞质呈酒红色，细胞核呈蓝色）。​

在分子水平检测方面，研究人员采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血浆中骨特异性碱性磷酸酶（BALP）的水平，通过 NAD 检测试剂盒测定 NAD⁺含量，并使用东芝 TBA40FR 型自动生化分析仪检测钙和磷的浓度，所有操作均严格遵循试剂盒或仪器说明书。对于基因表达分析，采用 TRIzol 法提取肱骨组织的 RNA，通过全波长酶标仪检测 RNA 纯度（D260/280 比值在 1.9-2.1 之间为合格），并使用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA，再利用 qPCR 试剂盒在 Bio-Rad CFX96 系统上进行实时定量 PCR 分析，基因表达水平采用 2^(-ΔΔCt) 法计算。此外，通过免疫组织化学和免疫荧光染色检测骨和结肠组织中 cGAS、STING、IL-6、IL-1β 和 TNF-α 等蛋白的表达，样本经 3% H₂O₂处理 10 分钟后，用 3% 牛血清白蛋白封闭 1 小时，加入一抗（1:200 稀释）孵育过夜，再加入相应的二抗（Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 或 HRP 标记的山羊抗兔二抗），最后通过 DAB 显色或 DAPI 核染色，使用 3DHISTECH 自动切片扫描系统获取图像，并通过 ImageJ 软件对阳性区域进行定量分析。​

为探究肠道菌群的变化，研究团队收集了对照组和中剂量暴露组大鼠的盲肠内容物，经干冰冷冻后保存于 - 80°C，交由 BMK Cloud 平台进行 16S rRNA 基因测序分析。通过 Chao1 指数和 Shannon 指数评估 α 多样性，利用线性判别分析和热图等方法比较各组间菌群丰度的差异。同时，对结肠组织进行 HE 染色以观察肠道形态变化（如肠壁肌层厚度、绒毛表面规则性、隐窝形态和杯状细胞数量等），并通过免疫组织化学染色分析炎症因子的表达。​

在体外实验中，研究人员选用人源 THP-1 单核细胞系，在含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、5% CO₂培养箱中培养。为诱导巨噬细胞分化，将 THP-1 细胞以 3×10⁵ cells/mL 的密度接种于 10 cm 细胞培养皿中，加入 100 ng/mL 的 佛波酯（PMA，购自 Abmole 公司，货号 M4647）处理 24 小时，通过光学显微镜观察细胞贴壁情况，并采用 RT-qPCR 验证巨噬细胞标志物的表达，以确认分化成功。​

为确定 BDE-209 和丁酸钠的处理浓度，研究团队采用 CCK-8 法检测细胞活性。将诱导后的巨噬细胞以 30,000 cells/100 μL 的密度接种于 96 孔板，分别加入不同浓度的 BDE-209（5、10、50、100、200、400、500 μM）和丁酸钠（5、10、100、500、1000、2000 μM）处理 24 小时后，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，37°C 孵育 1 小时，通过全波长酶标仪测定 450 nm 处的吸光度，以对照组的吸光度比值评估细胞活性，最终确定后续实验的暴露浓度为 BDE-209（5、50、100 μM）和丁酸钠（500 μM），并设置对照组、不同剂量 BDE-209 处理组以及高剂量 BDE-209 联合丁酸钠处理组，所有组的 DMSO 浓度均控制在 0.1%（v/v）以下。​

体外实验中的分子和细胞功能检测与体内实验类似，通过 ELISA 检测巨噬细胞培养上清中 IL-6 和 IL-1β 的含量，采用 RT-qPCR 分析相关基因的 mRNA 表达，TRAP 染色观察破骨细胞的分化情况。在破骨细胞诱导实验中，将巨噬细胞用含 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的 1640 完全培养基处理，每 48 小时换液一次，直至观察到大量破骨细胞形成。免疫荧光染色则用于检测巨噬细胞中 cGAS 和 STING 的表达，细胞经 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，0.2% Triton-X 透化 20 分钟后，加入一抗（1:200 稀释）4°C 孵育过夜，再加入荧光二抗（1:400 稀释）室温避光孵育 1 小时，最后通过 KEYENCE BZ-X800 全功能显微成像系统获取图像。​

统计分析方面，对于符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析（ANOVA）或 Student's t 检验；对于非正态分布的数据，则采用非参数检验，样本量小于 50 时通过 Shapiro-Wilk 检验进行正态性分析。所有数据均使用 SPSS 22.0 和 GraphPad Prism 9.5 软件分析，以均值 ± 标准误（Mean ± SEM）表示，p < 0.05 为差异具有统计学意义，p < 0.01 和 p < 0.005 为差异具有高度统计学意义。​

实验结果显示，在体内研究中，BDE-209 暴露导致大鼠前肢握力显著降低，且呈现一定的剂量依赖性。骨代谢指标检测发现，暴露组大鼠的血浆 BALP 水平升高，血清钙和磷含量降低，提示骨代谢异常。Micro-CT 分析表明，中剂量 BDE-209 暴露组大鼠的肱骨骨密度显著降低，骨小梁厚度和数量减少，骨小梁分离度和结构模型指数增加，表明骨微结构遭到破坏。

组织病理学检查显示，暴露组大鼠的肱骨骨小梁排列紊乱，骨髓腔出现大量空泡结构，生长板细胞排列疏松，TRAP 染色阳性区域增多，提示破骨细胞活性增强。分子水平上，BDE-209 暴露使肱骨中 PGC-1α 的表达显著降低，NAD⁺水平下降，而 cGAS-STING 通路被激活，同时 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 等促炎因子的 mRNA 和蛋白表达均显著上调，表明炎症衰老参与了 BDE-209 诱导的骨损伤过程。​

肠道方面，BDE-209 暴露导致大鼠结肠组织出现明显的病理改变，包括肠壁肌层增厚、绒毛表面不规则、U 型隐窝形态异常、杯状细胞数量减少以及炎症细胞浸润，结肠组织中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达也显著增加，与骨组织的炎症反应趋势一致。16S rRNA 测序分析显示，尽管两组的 α 多样性无显著差异，但菌群组成发生改变，其中毛螺菌科（Lachnospiraceae）的丰度显著降低，而毛螺菌科是肠道菌群中产丁酸盐的核心菌属。​

体外实验结果进一步验证了体内研究的发现，THP-1 细胞经 PMA 诱导后，CD11b、CD68 和 CD14 等巨噬细胞标志物的 mRNA 表达显著上调，表明成功分化为巨噬细胞。BDE-209 处理后，巨噬细胞中 M1 型巨噬细胞标志物（如 CD86）和破骨细胞标志物（如组织蛋白酶 K、TRAP）的 mRNA 表达显著增加，培养上清中 IL-6 和 IL-1β 的含量升高，且随着 BDE-209 浓度的增加而增强。而当同时加入丁酸钠时，这些促炎和破骨相关指标均被显著抑制。

破骨细胞诱导实验显示，BDE-209 暴露可促进巨噬细胞向破骨细胞分化，TRAP 阳性细胞数量增多，且呈剂量依赖性，而丁酸钠可明显减少破骨细胞的形成。免疫荧光分析表明，BDE-209 处理使巨噬细胞中 cGAS 和 STING 的表达显著增加，丁酸钠则可下调其表达，提示 cGAS-STING 通路在 BDE-209 诱导的破骨细胞分化中起重要作用，且丁酸钠的抑制作用可能与此通路相关。​

综合以上结果可以看出，BDE-209 暴露通过扰乱肠道菌群平衡（尤其是毛螺菌科减少），导致其代谢产物丁酸盐不足，进而激活 cGAS-STING 通路引发炎症衰老，促进破骨细胞分化和活性增强，最终导致骨密度降低和骨微结构破坏，而补充丁酸钠可通过抑制炎症反应和 cGAS-STING 通路，缓解 BDE-209 诱导的骨稳态紊乱。这一研究揭示了肠道菌群 - 炎症衰老 - 骨代谢之间的关联，为理解环境污染物对骨健康的影响提供了新的视角。