METTL14 介导的 m6A 修饰增强 USP22-ERα 轴驱动乳腺癌进展

ERα 作为配体依赖性转录因子，通过激活下游靶基因如 Cyclin D1 调控细胞周期进程。其蛋白稳定性受泛素化修饰严格调控，而泛素特异性蛋白酶 22（USP22）通过去泛素化作用维持 ERα 的蛋白丰度。然而，USP22-ERα 轴的转录后调控机制仍不明确。

N6 - 甲基腺苷（m6A）修饰作为真核生物中最普遍的 RNA 修饰方式，通过 "写"（如 METTL3/METTL14）、"擦"（如 FTO）、"读"（如 YTHDC1/YTHDF1）蛋白动态调控 RNA 代谢。近年来研究表明，m6A 修饰在肿瘤发生发展中发挥关键作用，但其在 ERα+ 乳腺癌中的具体机制尚未完全阐明。

一、研究方法

（一）细胞模型与试剂

人乳腺癌细胞系（MCF-7、T47D 等）及正常乳腺上皮细胞 MCF10A ，使用含 10% 胎牛血清的培养基培养。Actinomycin D（M4881，AbMole），MG132（蛋白酶体抑制剂）用于 mRNA 稳定性实验。

（二）siRNA 筛选与稳转细胞系构建

采用包含 m6A 相关基因的 siRNA 文库转染 MCF-7 细胞，通过 Western blot 筛选影响 USP22 表达的关键基因。构建 METTL14 shRNA 慢病毒载体，感染 MCF-7 和 T47D 细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定敲低细胞系。

（三）分子生物学实验

1. RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）：使用 Magna RIP Kit，以抗 METTL14、METTL3 或 IgG 抗体捕获 RNA - 蛋白复合物，通过 qPCR 检测 USP22 和 ERα mRNA 的富集量。
2. 甲基化 RNA 免疫沉淀（MeRIP）：采用 Magna MeRIP Kit，使用抗 m6A 抗体富集甲基化 RNA，qPCR 检测 USP22 和 ERα mRNA 的 m6A 修饰水平。
3. mRNA 稳定性分析：细胞经 Actinomycin D（M4881，AbMole）处理后，在不同时间点提取 RNA，RT-qPCR 检测 mRNA 半衰期。

（四）功能实验

1. 细胞增殖检测：CCK-8 法（AbMole）检测细胞活力，EdU 染色（AbMole）评估 DNA 合成，克隆形成实验分析长期增殖能力。
2. 迁移实验：Transwell 小室和划痕愈合实验检测细胞迁移能力。

（五）动物实验

NOD/SCID 小鼠（雌性，4-6 周）皮下注射稳定敲低 METTL14 的 MCF-7 细胞，植入雌激素缓释 pellets 模拟体内激素环境。通过 IVIS 成像系统监测肿瘤生长，免疫组化检测 Ki67 和 ERα 表达。

二、实验过程

（一）siRNA 文库筛选

将 MCF-7 细胞接种于 96 孔板，转染 siRNA 文库（每孔 10 nM），48 小时后裂解细胞，Western blot 检测 USP22 蛋白水平。发现敲低 METTL14 和 METTL3 显著降低 USP22 表达，进一步验证确认 METTL14 为关键调控因子。

（二）mRNA 稳定性实验

MCF-7 和 T47D 细胞分别转染 si-NC 或 si-METTL14，48 小时后加入 Actinomycin D（M4881，AbMole，5 μg/mL）处理，于 0、2、4、6 小时收集 RNA。RT-qPCR 结果显示，METTL14 敲低组 USP22 和 ERα mRNA 半衰期显著缩短。

（三）RIP-qPCR 验证

裂解 MCF-7 细胞，制备细胞裂解液，与抗 METTL14 抗体孵育过夜。磁珠捕获复合物后，提取 RNA 进行 qPCR。结果显示，METTL14 与 USP22 和 ERα mRNA 直接结合，敲低 METTL14 显著降低结合效率。

（四）MeRIP-qPCR 分析

提取 T47D 细胞总 RNA，超声破碎后与抗 m6A 抗体孵育。富集的甲基化 RNA 经纯化后进行 qPCR，发现 METTL14 敲低组 USP22 和 ERα mRNA 的 m6A 修饰水平显著下降。

（五）体内成瘤实验

将稳定敲低 METTL14 的 MCF-7 细胞（2×10^6）注射至小鼠右侧腋窝，同时植入雌激素 pellets。每周测量肿瘤体积，28 天后处死小鼠。结果显示，METTL14 敲低组肿瘤体积和重量显著小于对照组，免疫组化显示 Ki67 阳性细胞减少。

三、实验结果分析

（一）METTL14 调控 USP22 和 ERα 的表达

1. 基因表达水平：Western blot 和 RT-qPCR 结果显示，敲低 METTL14 显著降低 USP22 和 ERα 的蛋白及 mRNA 水平，过表达 METTL14 则显著上调其表达。
2. 临床相关性：UALCAN 和 GEPIA 数据库分析显示，METTL14 在乳腺癌组织中高表达，且与 USP22 和 ERα 表达呈正相关。

（二）m6A 修饰的机制验证

1. 结合能力：RIP 实验证实 METTL14 与 USP22 和 ERα mRNA 直接结合，敲低 METTL14 显著降低结合效率。
2. 甲基化水平：MeRIP 实验显示，METTL14 敲低导致 USP22 和 ERα mRNA 的 m6A 修饰水平下降，过表达野生型 METTL14（而非催化失活突变体 R298P）可恢复甲基化水平。
3. 稳定性调控：Actinomycin D（M4881，AbMole）处理实验表明，METTL14 通过 m6A 修饰延长 USP22 和 ERα mRNA 的半衰期。

（三）功能影响的验证

1. 细胞增殖：CCK-8 和 EdU 实验显示，敲低 METTL14 显著抑制 MCF-7 和 T47D 细胞的增殖能力，过表达 METTL14 则促进增殖。
2. 迁移能力：Transwell 和划痕实验结果一致表明，METTL14 敲低组细胞迁移能力显著下降。
3. 体内实验：动物实验证实，敲低 METTL14 抑制肿瘤生长，且 ERα 和 Ki67 表达降低。

（四）信号通路分析

1. ERα 稳定性：Co-IP 实验显示，敲低 METTL14 增加 ERα 的泛素化水平，过表达 USP22 可部分逆转这一效应。
2. 下游靶基因：敲低 METTL14 导致 Cyclin D1 表达下降，过表达 ERα 可恢复 Cyclin D1 水平及细胞增殖能力。

四、讨论与展望

本研究首次揭示了 METTL14 通过 m6A 修饰增强 USP22-ERα 轴促进乳腺癌恶性进展的机制。METTL14 作为 m6A"写手"，通过直接结合 USP22 和 ERα mRNA，增加其 m6A 修饰水平，进而延长 mRNA 半衰期，维持蛋白稳定性。YTHDC1 和 YTHDF1 分别作为 "读者" 蛋白，识别修饰后的 mRNA，进一步调控其功能。

研究结果为 ERα+ 乳腺癌的研究提供了新的潜在靶点。未来需进一步探索 METTL14 抑制剂的开发的可能性。