迷走神经刺激通过限制单核来源的炎症性 CCRL2⁺ 巨噬细胞生成削弱心功能不全

最新推荐文章于 2025-07-18 15:12:19 发布

试剂界的爱马仕

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本文链接：https://blog.youkuaiyun.com/tmp00001/article/details/149399057

心力衰竭（HF）的病理网络始终存在交感—副交感失衡这一核心环节，迷走神经（vagus nerve）张力下降与交感输出增强共同驱动心肌重构。传统电刺激迷走神经虽能改善症状，却因同时激活传入与传出纤维，诱发副作用而难以深入机制研究。

近年来，光遗传学（optogenetics）以时空精度高、细胞类型特异的优势为神经调控带来新范式。Li 等人在 2025 年发表于 Immunity 的《Optogenetic vagal nerve stimulation attenuates heart failure by limiting the generation of monocyte-derived inflammatory CCRL2⁺ macrophages》，首次将光遗传学应用于迷走神经传出支，揭示了迷走—免疫轴通过 α7nAChR-NRF2 通路抑制 CCRL2⁺ 巨噬细胞的新机制，并在动物与临床样本中完成闭环验证。

研究背景
HF 患者外周血乙酰胆碱（ACh）水平与左室射血分数呈正相关，提示迷走张力与心功能直接挂钩。既往研究聚焦迷走神经整体刺激，缺乏对传出支单细胞水平活动的精确干预。单核来源巨噬细胞在压力负荷模型中迅速浸润心肌，CCR2⁺ 亚群已被报道促纤维化，但对 CCRL2⁺ 群体功能尚属空白。Li 等人推测，副交感神经通过局部神经递质直接调控心肌巨噬细胞分化与功能，从而限制病理性重塑。

研究设计与方法

光遗传学构建
团队选用 ChAT-Cre 小鼠，在迷走背运动核（DVMN）注射 rAAV-ChAT-hChR2(H134R)-EGFP 病毒，实现胆碱能传出神经元特异性表达视紫红质通道蛋白。光纤植入后，每日 30 min、10 Hz、445 nm 蓝光刺激，持续 8 周，确保仅激活传出纤维。对照组注射 rAAV-ChAT-EGFP 并接受假照射。所有手术与刺激参数经 2.35 T 磁共振验证，光纤误差 <100 μm。
压力负荷模型
8–10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠经横向主动脉缩窄（TAC）建立压力负荷模型。术后 4 周开始，动物随机分入生理盐水、donepezil（5 mg/kg/d）或 EVP-6124（2 mg/kg/d）三组，均经饮水给药。剂量换算依据体表面积系数，EVP-6124 与 donepezil 均购自 AbMole（目录号 M7227、M8888），纯度≥99%，批次间稳定性经 HPLC 验证。
多组学解析
心脏单细胞 RNA 测序：术后 8 周取左室组织，采用 MACS Neonatal Heart Dissociation Kit 获得单细胞悬液，10x Genomics 平台捕获 CD45⁺ 免疫细胞，UMAP 聚类结合 SCENIC 构建转录因子调控网络。
流式细胞术：按 CD45⁺CD11b⁺CD64⁺ 门控，再分选 Lyve1⁺、CD74⁺、Trem2⁺ 与 CCRL2⁺ 四群巨噬细胞，用于体外共培养。
共培养体系：新生小鼠心肌细胞（CM）与成纤维细胞（CF）分别与上述巨噬细胞在 0.4 μm Transwell 中共培养 48 h，评估细胞面积、增殖及胶原分泌。
遗传干预
Ccrl2-Cre 与 Rosa26-iDTR 小鼠杂交，给予白喉毒素（10 ng/g，i.p.，每 5 d 一次）实现 CCRL2⁺ 巨噬细胞特异性耗竭。
α7nAChR 巨噬细胞条件过表达：将 α7 fl/fl-OE 小鼠与 Ccrl2-Cre 交配，Cre 重组后 CCRL2⁺ 巨噬细胞特异表达 α7 亚基。
NRF2 功能验证：使用 AbMole 提供的 PNU-282987（α7 激动剂，M7227）与甲基牛扁亭碱 MLA（拮抗剂）干预骨髓来源巨噬细胞，并配合 NRF2 siRNA 及 NRF2 过表达慢病毒验证信号轴。

实验结果

光遗传激活迷走传出支显著抑制 TAC 诱导的心肌肥厚、纤维化与射血分数下降，HW/BW/TL、横截面积、胶原体积分数均明显改善。
单细胞图谱揭示，压力负荷后心脏 CD45⁺ 免疫细胞 66% 为巨噬细胞，其中 CCRL2⁺ 亚群占比 15%，高表达 TNF-α 信号通路关键基因（Tnfrsf4、Ccl2、Cxcl1）。VNS 使该群比例降至 5%，同时下调 TNF-α 响应评分。
轨迹分析（CytoTRACE + Monocle2）显示 CCRL2⁺ 巨噬细胞源于 Ly6C^hi 单核细胞，VNS 减少骨髓共同髓系祖细胞（CMP）数量及循环单核细胞，提示迷走神经远程抑制髓系生成。
特异性耗竭 CCRL2⁺ 巨噬细胞后，TAC 引起的心肌重构与功能恶化均被显著削弱，证实该群细胞在病理性重塑中的核心作用。
CCRL2⁺ 巨噬细胞与 CM/CF 共培养实验表明，其可显著诱导 CM 面积增大、CF α-SMA 表达升高及胶原分泌，而 CCRL2⁻ 巨噬细胞无此效应。
α7nAChR 在 CCRL2⁺ 巨噬细胞表面富集，光遗传 VNS 的益处依赖于该受体：Chrna7⁻/⁻ 小鼠接受同样刺激后，心功能无改善，巨噬细胞浸润与炎症基因表达依旧高涨。
机制层面，α7nAChR 激活通过抑制 NF-κB p65 核转位、增强 Akt-GSK-3β-Fyn 轴，促进 NRF2 核内积累，从而抑制 TNF-α 下游基因。NRF2 siRNA 可逆转 α7 激动剂的保护效应，而过表达 NRF2 模拟 α7 激活表型。
临床样本验证：HF 患者左室组织可见 CD68⁺CCRL2⁺ 巨噬细胞浸润，其密度与纤维化、心肌细胞横截面积及凋亡指数正相关；血清 ACh 与心率变异性指数呈正相关，与 CXCL10、CCL2、chemerin 负相关，进一步支持迷走—巨噬细胞轴在人体中的保守性。
干预实验：TAC 术后 4 周开始给予 EVP-6124（AbMole M7227）或 donepezil（AbMole M8888）连续 4 周，EVP-6124 较 donepezil 更显著减少 CCRL2⁺ 巨噬细胞、降低心肌重构指标并提升射血分数。转录组分析显示 EVP-6124 组炎症与纤维化通路显著下调，氧化磷酸化上调，提示 α7 选择性激动剂的潜在优势。

结论与展望
本研究以光遗传学为工具，首次在单细胞分辨率描绘迷走神经—巨噬细胞—心肌细胞三方互作，提出 CCRL2⁺ 巨噬细胞为心衰进展的关键节点。迷走传出支通过 α7nAChR-NRF2 轴抑制该细胞群的炎症输出，不仅能阻断心脏局部损伤，还通过骨髓远程调控减少单核细胞供给。EVP-6124 与 donepezil 的对比实验为 α7 靶向调控提供了剂量与效能数据，而 AbMole 高纯度化合物确保了实验可重复性。未来，无创迷走神经调控技术或 α7nAChR 选择性激动剂，有望为心衰管理提供精准、低副作用的新思路。