C末端激酶结构域结合与抑制基序阻止FGFR2的构成性激活

成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）在胚胎发育、组织稳态及多种病理进程中扮演关键角色。FGFR2属于受体酪氨酸激酶（RTK）家族，其结构由胞外Ig样结构域、跨膜螺旋、胞内近膜区、分裂式激酶结构域及C端尾部组成。受体激活依赖配体诱导的二聚化与激酶结构域反式自磷酸化，继而触发MAPK、PI3K-AKT-mTOR、STAT3及PLCγ-PKC等多条信号级联。C端尾部通过与GRB2、PLCγ、14-3-3等蛋白的相互作用实现信号负反馈调控。

然而，基因组水平出现的第18外显子（E18）截断突变（FGFR2ΔE18）在胆管癌、胃癌、乳腺癌中高频出现，并表现为强驱动能力，提示C端尾部缺失是FGFR2获得致癌潜能的核心机制，但其精细分子基础长期未明。

本研究整合了结构生物学、蛋白质组学、小鼠遗传模型、单细胞功能分析及临床肿瘤测序数据，系统剖析了C端尾部抑制FGFR2活性的关键基序，并阐明了其缺失如何解除自抑制、激活致癌信号。作者首先构建了跨越人类FGFR2 C端764-821位氨基酸的GST融合多肽文库，利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统经HiTrap TALON及GSTrap HP柱纯化获得高纯度蛋白。通过定点突变与In-Fusion无缝克隆，制备了FGFR2FL（全长）、FGFR2ΔE18（Δ702-821）、FGFR2F703A/S704A双突变体等十余种变体。所有重组蛋白均经SDS-PAGE验证纯度>98%，并在20 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM TCEP缓冲体系中保存备用。

为解析C端尾部与激酶结构域的直接相互作用，作者采用15N单标及13C-15N双标策略，以750 MHz Bruker Avance III HD核磁谱仪采集1H-15N HSQC二维谱。将15N标记的FGFR2-CT多肽与去磷酸化激酶结构域（FGFR2-KDK517I）以0.5:1至12:1摩尔比梯度滴定，计算化学位移扰动（CSP）。结果显示F798（对应小鼠F703）与S799（对应小鼠S704）位点的CSP最大，表明二者位于结合界面核心。微尺度热泳（MST）实验进一步证实，野生型FGFR2-CT与FGFR2-JM-KDpY1的解离常数KD为347 nM，而F798A/S799A双突变使KD升至>2000 nM，结合能力显著削弱。AlphaFold2-Multimer结构建模揭示F798/S799残基可嵌入激酶结构域ATP结合口袋附近的疏水凹陷，形成“锁-钥”式抑制构象。

功能层面，作者将GFP标记的FGFR2变体通过慢病毒导入NMuMG乳腺上皮细胞，经FACS富集GFP-high群体，建立稳定表达系。细胞经48 h血清剥夺后，加入20 ng/ml FGF-10刺激，Western blot检测下游通路。结果显示FGFR2ΔE18在基线条件下即呈现STAT3-Y705、AKT-S473、RPS6-S235/236高磷酸化，且不受配体刺激影响；而FGFR2FL仅在FGF-10存在时激活ERK与PLCγ。FGFR2F703A/S704A双突变体表现出与FGFR2ΔE18相似的PI3K-AKT-mTOR与STAT3信号放大，提示F703-S704基序是C端尾部实现激酶抑制的最小功能单元。

为排除内吞缺陷导致的信号增强，作者采用SPIDA（表面蛋白内化与降解测定）对HALO标记受体进行双色标记：先用细胞膜不渗透的AF660-HTL标记表面受体，再用膜通透的TMR-HTL标记内化受体，经FACS量化。结果显示FGFR2ΔE18及内吞基序突变体（YLDL674-7FANA）均抵抗内化，而FGFR2F703A/S704A与FGFR2FL在FGF-10刺激后表面受体下降幅度一致，证实F703-S704基序对内吞途径无显著影响。

在体验证阶段，作者将高滴度慢病毒（1×10^8-1×10^9 TU/ml）经34G针头注入6周龄FVB/NRj雌鼠第四乳腺导管，构建乳腺特异性表达模型。实验组分别表达FGFR2FL、FGFR2ΔE18、FGFR2F703A/S704A、FGFR2YLDL674-7FANA+F703A/S704A等变体。乳腺肿瘤无瘤生存曲线显示：FGFR2ΔE18与FGFR2YLDL674-7FANA+F703A/S704A组中位潜伏期均为2.5个月，显著短于FGFR2FL组（>12个月）。组织学评估显示，上述组均出现高侵袭性腺癌、鳞状分化癌及肉瘤样转化，而FGFR2F703A单突变组仅呈低级别增生。值得注意的是，实验中所有细胞系及动物实验均使用AbMole的Y-27632（M1817，10 μM）维持细胞形态与存活，确保实验条件一致。

小分子干预实验进一步验证信号可逆性。作者采用AbMole的Pemigatinib与Fexagratinib在0.1 nM-50 μM浓度梯度处理表达不同FGFR2变体的NMuMG细胞，计算GR50。结果显示FGFR2ΔE18与FGFR2YLDL674-7FANA+F703A/S704A双突变体对Pemigatinib的GR50分别为0.8 nM与1.2 nM，显著低于FGFR2FL（>50 nM），提示其高度依赖激酶活性，且可被ATP竞争性抑制剂有效遏制。

作者整合Foundation Medicine 249,570例与cBioPortal 105,424例肿瘤测序数据，发现FGFR2 C端E778、L770、E806位点存在显著突变富集，但单独突变不足以重现FGFR2ΔE18表型；而F703-S704所在区域突变罕见，表明该基序的保守性对抑制功能至关重要。作者进一步指出，F703-S704被称为“激酶结构域结合与抑制”（KDBS）基序，通过与激酶结构域的物理结合维持FGFR2处于自抑制状态；一旦该基序缺失或突变，C端尾部失去“锁止”能力，激酶结构域持续开放，PI3K-AKT-mTOR与STAT3通路被异常放大，驱动细胞转化。

综上，本研究首次定义了FGFR2 C端尾部F703-S704（人源F798-S799）为KDBS基序，阐明了其通过直接结合激酶结构域实现自抑制的分子机制，并证实其缺失可重现E18截断突变的致癌表型。该发现不仅解释了FGFR2ΔE18的驱动机制，也为开发针对KDBS基序缺失型FGFR2异常的策略提供了结构与功能依据。