长链非编码RNA USP2-AS1通过PHLDA2_PI3K_AKT轴促进结直肠癌发生发展

长链非编码 RNA（lncRNAs）通常被认为是长度超过 200 个核苷酸且缺乏编码潜力的 RNA 分子，不过也有研究表明部分 lncRNAs 能够编码具有生物活性的微肽。它们的亚细胞定位不同，介导基因表达的途径也存在差异，在细胞质中可作为竞争性内源 RNA（ceRNAs）、调节 mRNA 稳定性并介导蛋白质修饰，在细胞核中则作为增强子、诱饵、支架和向导参与基因表达调控。

已有研究证实，lncRNAs 的异常表达与人类癌症的发生发展密切相关，它们可作为肿瘤促进因子或抑制因子，在细胞生长、侵袭、迁移、凋亡等多种生物学过程中发挥调控作用。因此，深入探究 lncRNAs 在结直肠癌中的表达水平、功能及确切调控机制，有望为发现新的临床诊断和预后生物标志物提供重要线索。

USP2-AS1 是近年来在染色体 11q23.3 上发现的一种 lncRNA，已有研究表明其通过与 YAP1 结合、下调磷酸化 YAP 使 Hippo 信号失活，从而促进结直肠癌进展，也有研究显示其在卵巢癌和头颈部鳞状细胞癌中发挥促癌作用，但 USP2-AS1 在结直肠癌中的作用及机制尚未完全阐明，这正是本研究开展的背景。​

本研究《LncRNA USP2-AS1 facilitates colorectal cancer development through the PHLDA2/PI3K/AKT axis》细胞系方面，结直肠癌细胞系（LOVO、HCT116、SW480、DLD1、SW620、HT-29）和人正常结肠上皮细胞系（FHC 细胞系）培养时，根据不同细胞系的需求，分别采用 F12K、RPMI 1640 或 DMEM 培养基，并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素，在 37℃、5% CO₂的培养条件下进行孵育。​

在细胞转染实验中，小干扰 RNA（siRNAs）用于稳定转染的短发夹 USP2-AS1 被选用于异种移植肿瘤实验，通过 qRT-PCR 检测相关基因的相对表达水平，其中 U6（用于 miR-134-5p）和 GAPDH（用于 USP2-AS1、PHLDA2、IGF2BP2）作为内参基因，数据采用 2ΔΔCt 法处理。Western blot 实验中，使用 RIPA 裂解缓冲液提取蛋白质，经 10% 或 15% SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至 PVDF 膜，膜用 5% 牛奶封闭 1 小时，随后在 4℃下与一抗孵育过夜，再与相应二抗在室温下孵育 2 小时，最后使用 ECL 试剂显色，所用抗体包括抗 IGF2BP2、抗 PHLDA2、抗 AKT、抗 p-AKT、抗 PI3K、抗 p-PI3K、抗 GAPDH、抗 β-actin 等。​

细胞计数 Kit-8（CCK-8）实验中，将经不同处理的结直肠癌细胞置于 96 孔培养板中，每 24 小时使用 CCK-8 试剂检测 450nm 处的吸光度。集落形成实验则是将 500-1000 个结直肠癌细胞 / 孔接种于 6 孔板中，14 天后用 PBS 洗涤，再用 0.1% 结晶紫染色 20 分钟。5 - 乙炔基 - 2'- 脱氧尿苷（EdU）实验中，结直肠癌细胞在 10mM EdU溶液中孵育 2 小时，经 4% 中性多聚甲醛固定 15 分钟、0.3% Triton X-100 通透 10 分钟后，用 EdU 反应缓冲液染色 30 分钟，再用 Hoechst 33342 溶液染色 10 分钟，最后通过荧光显微镜观察。细胞迁移实验中，上室加入 6-8×10⁴个细胞及 300μL 无血清培养基，下室加入 700μL 含 20% FBS 的培养基，48-72 小时后用 0.1% 结晶紫染色 20 分钟，在显微镜下观察。细胞凋亡实验采用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒，将 5×10⁵个细胞重悬于 500μL 结合缓冲液中，加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI 染色液，孵育 10 分钟后，通过流式细胞术检测凋亡细胞。​

动物实验选用 4-6 周龄的 BALB/c 雌性裸鼠，饲养于 SPF 级环境中，每只裸鼠皮下注射 1×10⁶个经不同预处理的细胞，每 4 天测量一次肿瘤大小，计算公式为：体积 = 1/2× 长度 × 宽度 ²，22 天后处死裸鼠，分离肿瘤并称重。亚细胞分离定位实验使用 NE-PER 核和细胞质提取试剂盒分离结直肠癌细胞的细胞核和细胞质，通过 qRT-PCR 检测细胞质和细胞核中 GAPDH 和 U6 的 RNA 水平。双荧光素酶报告基因实验中，将 2×10⁴个 HEK293 细胞 / 孔接种于 12 孔板，转染 miR-134-5p 模拟物与野生型（WT）-USP2-AS1 / 突变型（MUT）-USP2-AS1 或 WT-PHLDA2/MUT-PHLDA2，48 小时后用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。​

RNA 稳定性实验中，使用放线菌素 D (Abmole) 处理结直肠癌细胞，分别在 0、4、8、12 小时收集细胞，按照前述方法进行总 RNA 提取和 qRT-PCR 检测。RNA 免疫沉淀（RIP）实验采用 Magna RIP 试剂盒，经处理的结直肠癌细胞在冰上用 RIP 裂解缓冲液裂解，与连接抗 IGF2BP2 和抗 IgG 的磁珠在 4℃下孵育过夜，用洗脱缓冲液分离沉淀的 RNA，最后通过 qRT-PCR 检测获得的 RNA。免疫荧光实验使用 Immunol Fluorence 染色试剂盒，细胞用 4% 中性多聚甲醛固定 10 分钟，室温下用封闭液封闭 1 小时，4℃下与抗 IGF2BP2 或抗 PHLDA2 孵育过夜，最后在暗处与荧光标记的二抗孵育 1 小时，用 DAPI 染色细胞核后通过共聚焦显微镜拍照。所有数据采用 GraphPad Prism 8.0 处理，两组间差异采用 Student's t 检验，临床病理数据采用卡方检验，P<0.05 被认为具有统计学意义，数据以均数 ± 标准差（SD）表示。​

研究结果显示，USP2-AS1 在结直肠癌组织中高表达，qRT-PCR 检测 50 对结直肠癌及癌旁正常组织发现，USP2-AS1 在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且其表达与 TNM 分期、淋巴结转移和远处转移相关，而与年龄、性别和肿瘤位置无关。GEPIA 数据库分析表明，USP2-AS1 高表达的患者总生存期较短，在结直肠癌细胞系中，与 FHC 细胞系相比，USP2-AS1 在 HCT116 和 SW480 细胞中表达显著升高，因此选择这两种细胞系进行后续研究。​

为探究 USP2-AS1 的生物学功能，设计了三种 siRNA 下调 USP2-AS1 的表达，并验证了敲低效率，选取 si-USP2-AS1-1# 和 3# 进行后续实验。CCK-8 实验显示，USP2-AS1 敲低后结直肠癌细胞的生长能力降低；集落形成实验表明，USP2-AS1 敲低抑制了结直肠癌细胞的集落形成能力；EdU 实验也证实 USP2-AS1 敲低抑制了结直肠癌细胞的增殖能力；迁移实验显示，下调 USP2-AS1 抑制了结直肠癌细胞的迁移；细胞凋亡实验则发现，USP2-AS1 下调提高了结直肠癌细胞的凋亡率。动物实验中，接种经不同处理的 SW480 和 HCT116 细胞后，sh-USP2-AS1 组小鼠的肿瘤体积和重量均小于 sh-NC 组，这些结果表明下调 USP2-AS1 可减少结直肠癌细胞的生长和迁移，促进其凋亡。​

在 USP2-AS1 过表达实验中，上调结直肠癌细胞系中 USP2-AS1 的表达并验证了过表达效率。CCK-8 实验显示，USP2-AS1 上调显著增强了结直肠癌细胞的生长能力；集落形成实验证实，USP2-AS1 上调促进了结直肠癌细胞的集落形成能力；EdU 实验表明，USP2-AS1 过表达促进了结直肠癌细胞的增殖；迁移实验发现，USP2-AS1 过表达增加了结直肠癌细胞的迁移能力，进一步证明 USP2-AS1 可促进结直肠癌细胞的增殖和迁移。​

为探究 USP2-AS1 作用的分子机制，对 USP2-AS1 敲低后基因表达变化进行 RNA 测序，基因本体论（GO）分析对差异表达基因进行了分类，发现有 297 个基因表达升高，347 个基因表达降低。通过与 GEO 数据库中的三个数据集（GSE33113、GSE35602、GSE50117）交叉分析，获得了四个基因（KRT80、CDK1、MSX1、PHLDA2），选取研究最少的 PHLDA2（NCBI，基因 ID：7262）作为 USP2-AS1 的下游靶标。GEPIA 数据库分析显示，PHLDA2 在结肠腺癌组织（n=275）中较正常组织（n=349）上调，在直肠腺癌组织（n=92）中较正常组织（n=318）也显著升高。对 50 对组织中 PHLDA2 和 USP2-AS1 的表达水平检测分析发现，两者呈正相关。

在 SW480 和 HCT116 细胞中，USP2-AS1 下调后 PHLDA2 的 mRNA 和蛋白水平均下调，验证了之前的 RNA 测序结果；而 USP2-AS1 过表达则上调了 PHLDA2 的 mRNA 和蛋白水平。设计 siRNA 下调结直肠癌细胞系中 PHLDA2 的表达，并检测了敲低效率。已有研究报道 PHLDA2 通过 PI3K/AKT 信号通路调节结直肠癌的上皮间质转化（EMT）和自噬，对 USP2-AS1 敲低后表达改变的基因进行 KEGG 分析发现，这些基因可能与 PI3K/AKT 信号通路相关。

进一步实验显示，USP2-AS1 敲低可下调 p-PI3K 和 p-AKT 的蛋白水平，而 USP2-AS1 过表达则产生相反的效果， rescue 实验表明，USP2-AS1 过表达可上调 p-PI3K 和 p-AKT 的蛋白水平，而 PHLDA2 下调可抵消这种作用，说明 USP2-AS1/PHLDA2 轴可调节 PI3K/AKT 信号通路。​

rescue 实验还验证了 USP2-AS1 是否通过上调 PHLDA2 表达促进结直肠癌进展，CCK-8 实验证明，过表达 USP2-AS1 增强了结直肠癌细胞的生长能力，而下调 PHLDA2 可部分逆转这种作用；集落形成和 EdU 实验也得到类似结果，即 USP2-AS1 上调促进结直肠癌细胞的增殖能力，但 PHLDA2 敲低可逆转这种作用；迁移实验显示，PHLDA2 敲低逆转了 USP2-AS1 上调对细胞迁移的影响，表明 USP2-AS1 可通过上调 PHLDA2 表达促进结直肠癌进展。​

亚细胞分离实验检测 USP2-AS1 在结直肠癌细胞中的定位发现，USP2-AS1 在 SW480 细胞中主要分布在细胞质，在 HCT116 细胞中则在细胞核和细胞质中均有分布，提示 USP2-AS1 可能在转录或转录后水平发挥作用。鉴于 RNA 结合蛋白（RBPs）可通过与 lncRNAs 相互作用介导 mRNA 表达，推测 USP2-AS1 可能通过结合某种 RBP 调节 PHLDA2 的表达。通过 Starbase 在线程序预测结合 USP2-AS1 和 PHLDA2 的 RBPs，发现 34 个可同时结合两者的 RBPs，再通过 RBPsuite 数据库预测 USP2-AS1 与这 34 个 RBPs 的结合分数，获得分数最高的三个 RBPs：SLTM、RBFOX2 和 IGF2BP2。GEPIA 在线程序预测结直肠癌中 PHLDA2 与这三个 RBPs 的相关性，发现仅 IGF2BP2 与 PHLDA2 相关，对 50 对组织中 IGF2BP2 和 PHLDA2 的表达水平检测分析也发现两者呈正相关，因此选择 IGF2BP2 进行后续实验。

免疫荧光实验发现，IGF2BP2 和 PHLDA2 主要定位于 SW480 和 HCT116 细胞的细胞质，RIP 实验证实 IGF2BP2 可与 USP2-AS1 和 PHLDA2 结合。构建 siRNA 下调结直肠癌细胞系中 IGF2BP2 的表达，并检测了敲低效率，实验显示，USP2-AS1 下调后，结直肠癌细胞中 IGF2BP2 的 mRNA 和蛋白水平无显著变化，USP2-AS1 过表达也不改变 IGF2BP2 的表达，IGF2BP2 敲低后 USP2-AS1 的表达也无显著变化，对 50 对组织中 USP2-AS1 和 IGF2BP2 的表达水平检测分析发现两者无显著相关性，说明 USP2-AS1 和 IGF2BP2 不能相互调节表达。

但实验发现，IGF2BP2 下调后 PHLDA2 的 mRNA 和蛋白水平降低，结合已有研究中 IGF2BP2 可通过与 lncRNAs 结合影响下游 mRNA 稳定性的报道，使用 Abmole 公司的放线菌素 D 处理 SW480 和 HCT116 细胞，探究 IGF2BP2 是否影响 PHLDA2 的 mRNA 稳定性，结果显示 IGF2BP2 下调后 PHLDA2 的 mRNA 稳定性显著降低，此外，USP2-AS1 过表达可上调 PHLDA2 的 mRNA 和蛋白水平，而 IGF2BP2 下调可抵消这种作用，表明 USP2-AS1 通过与 IGF2BP2 相互作用稳定 PHLDA2 的 mRNA。​

还假设 USP2-AS1 可竞争性结合 miRNAs，通过 Starbase 数据库预测可能与 USP2-AS1 和 PHLDA2 相互作用的 miRNAs，筛选出 miR-134-5p 和 miR-3164。检测 USP2-AS1 敲低或过表达后 miR-134-5p 和 miR-3164 的表达，发现仅 miR-134-5p 与 USP2-AS1 呈负相关。检测 miR-134-5p 的敲低和上调效率后发现，上调 miR-134-5p 可下调 PHLDA2 的表达，miR-134-5p 下调则上调 PHLDA2 的表达，进一步验证了结论。

实验还显示，USP2-AS1 敲低可下调 PHLDA2 的 mRNA 和蛋白水平，而 miR-134-5p 下调可部分抵消这种作用。将 miR-134-5p 模拟物与 WT-USP2-AS1 或 MUT-USP2-AS1 共转染 HEK293 细胞，发现 WT-USP2-AS1 组的荧光素酶活性降低，而 MUT-USP2-AS1 组无明显变化，同样，共转染 miR-134-5p 模拟物与 WT-PHLDA2 或 MUT-PHLDA2 后，WT-PHLDA2 组的荧光素酶活性降低，MUT-PHLDA2 组无明显变化，说明 USP2-AS1 可通过竞争性结合 miR-134-5p 调节 PHLDA2 的表达。​

最后，rescue 实验验证 USP2-AS1 是否通过与 miR-134-5p 相互作用促进结直肠癌发展，CCK-8 实验证明，USP2-AS1 敲低抑制结直肠癌细胞的生长，但 miR-134-5p 抑制剂可部分逆转这种抑制作用；集落形成和 EdU 实验也证实，USP2-AS1 下调抑制结直肠癌细胞的增殖，而 miR-134-5p 下调可部分逆转这种抑制作用；迁移实验显示，miR-134-5p 下调可部分挽救 USP2-AS1 下调对细胞迁移的影响，表明沉默 USP2-AS1 可减少结直肠癌细胞的生长和迁移，而沉默 miR-134-5p 可部分挽救这些作用。​

综上所述，本研究证实 USP2-AS1 在结直肠癌中表达升高，可增强结直肠癌细胞的生长和迁移能力，减少细胞凋亡。其作用机制为 USP2-AS1 通过招募 IGF2BP2 和吸附 miR-134-5p 来上调 PHLDA2 的表达，进而激活 PI3K/AKT 信号通路，促进结直肠癌的恶性进展，提示 USP2-AS1 可能是结直肠癌潜在的生物标志物和干预靶点。