Prohibitin 2通过激活ERK，赋予NADPH氧化酶1介导的胞质氧化信号

Prohibitin 2（PHB2）作为一种进化保守的蛋白质，最初被发现定位于线粒体，通过维持线粒体结构稳定和调控氧化磷酸化参与细胞能量代谢。然而，近年研究表明 PHB2 可通过核转位或与胞质蛋白相互作用，在肿瘤细胞增殖、凋亡抵抗等过程中发挥作用，但其在胃癌中的表达模式及具体功能机制尚未明确。​

氧化应激作为肿瘤微环境的重要特征，主要通过活性氧（ROS）的过量产生引发脂质、蛋白质和 DNA 的氧化损伤，进而激活下游信号通路促进肿瘤进展。NADPH 氧化酶 1（NOX1）作为 ROS 产生的关键酶，在胃癌组织中常呈高表达，其介导的胞质 ROS 积累被证实与细胞恶性表型密切相关。 extracellular 信号调节激酶（ERK）通路作为经典的促癌信号轴，可被 ROS 激活并参与细胞周期调控和上皮间质转化（EMT）过程。已有研究提示 PHB2 可能通过与氧化应激相关蛋白相互作用影响信号传导，但 PHB2 是否通过调控 NOX1 介导的 ROS 产生及 ERK 激活参与胃癌进展，仍是尚未解答的科学问题，这也构成了本研究的核心探索方向。​

细胞实验选用人胃癌细胞系（MGC-803、SGC-7901、BGC-823）及正常胃黏膜上皮细胞系（GES-1），细胞培养于含 10% 胎牛血清（Gibco）的 RPMI-1640 培养基（HyClone）中，在 37℃、5% CO₂恒温培养箱中传代，选取对数生长期细胞进行后续实验。动物实验选用 4-6 周龄 BALB/c 裸鼠（SPF 级），饲养于无菌环境中，用于构建皮下异种移植瘤模型及腹腔转移模型。​

细胞功能实验中，PHB2 敲低采用脂质体 Lipo3000 介导的 siRNA 转染，转染后 48 小时通过 Western blot 验证敲低效率（选取敲低效率＞70% 的 siRNA 序列用于后续实验）；过表达实验则通过慢病毒载体构建稳定高表达 PHB2 的细胞株，经嘌呤霉素筛选后扩大培养。细胞增殖能力检测采用 CCK-8 法，分别在 0、24、48、72 小时测定 450nm 吸光度；克隆形成实验将 500 个细胞 / 孔接种于 6 孔板，14 天后用 0.1% 结晶紫染色计数克隆数；迁移与侵袭实验使用 8μm 孔径 Transwell 小室，侵袭实验需提前铺基质胶（1:8 稀释），24 小时后固定染色并计数穿膜细胞。​

氧化应激相关检测中，胞质 ROS 水平通过 AbMole 的 ROS 检测试剂盒测定，细胞经处理后加载 10μM DCFH-DA 探针，37℃孵育 20 分钟，流式细胞仪检测 FL1 通道荧光强度；线粒体 ROS 采用 MitoSOX Red 探针标记，共聚焦显微镜观察荧光分布。NOX1 活性检测采用 lucigenin 化学发光法，反应体系含 50μM lucigenin、100μM NADPH 及细胞裂解液， luminometer 测定 5 分钟内的相对发光单位（RLU）。​

分子机制探究采用免疫共沉淀（Co-IP）实验：收集 1×10⁷个细胞，用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液冰上裂解 30 分钟，上清与 PHB2 抗体或 IgG 对照在 4℃孵育过夜，加入 Protein A/G 琼脂糖珠继续孵育 2 小时，洗涤后煮沸洗脱，Western blot 检测结合的 NOX1 蛋白。双荧光素酶报告基因实验构建 NOX1 启动子 luciferase 质粒，与 PHB2 过表达质粒共转染 293T 细胞，48 小时后用双荧光素酶检测系统测定相对活性。免疫荧光实验中，细胞爬片经 4% 多聚甲醛固定、0.3% Triton X-100 通透后，依次孵育 PHB2（1:200）与 NOX1（1:150）一抗及荧光二抗，DAPI 染核，共聚焦显微镜观察蛋白共定位。​

动物实验中，皮下移植模型将 1×10⁷个稳定转染的 MGC-803 细胞接种于裸鼠右侧背部，每周测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽 ²/2），4 周后处死裸鼠剥离肿瘤称重；腹腔转移模型通过尾静脉注射 5×10⁶个细胞，6 周后解剖观察腹腔结节数并进行 HE 染色验证。部分裸鼠在接种后隔天腹腔注射 ML171（10mg/kg）以验证 NOX1 的作用，实验过程中监测小鼠体重及一般状态。​

样本分析显示，胃癌组织中 PHB2 的 mRNA 及蛋白水平显著高于癌旁组织（P<0.01），且其高表达与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移正相关（χ² 检验，P<0.05），Kaplan-Meier 分析表明 PHB2 高表达患者的 5 年生存率显著降低（Log-rank 检验，P=0.003），提示 PHB2 可能作为胃癌预后不良的生物标志物。细胞系检测发现，MGC-803 和 SGC-7901 细胞中 PHB2 表达显著高于 GES-1，故选取这两株细胞进行功能实验。​

PHB2 敲低实验显示，与对照组相比，si-PHB2 组细胞的增殖能力（CCK-8 及克隆形成）显著降低（P<0.01），迁移和侵袭细胞数减少约 50%（P<0.01）；而过表达 PHB2 则呈现相反效应，且能促进 GES-1 细胞的恶性表型转化。机制层面，PHB2 过表达使胞质 ROS 水平升高约 2.3 倍（流式检测），NOX1 活性增强（RLU 增加 1.8 倍），p-ERK1/2 蛋白水平上调；反之，PHB2 敲低可降低 ROS 产生及 ERK 磷酸化。加入 ML171（1μM）或 PD98059（20μM）后，PHB2 过表达诱导的细胞增殖和迁移能力被显著抑制（P<0.01），证实 NOX1-ROS-ERK 轴参与 PHB2 的促癌效应。​

Co-IP 实验证实 PHB2 与 NOX1 在胞质中存在相互作用，免疫荧光显示两者共定位于靠近细胞膜的胞质区域，且 PHB2 过表达可增强这种共定位。双荧光素酶实验表明 PHB2 对 NOX1 启动子活性无显著影响，而 Cycloheximide 追踪实验显示 PHB2 过表达可延长 NOX1 蛋白的半衰期（从 2.1 小时延长至 4.3 小时），提示 PHB2 可能通过抑制 NOX1 降解维持其蛋白稳定性。进一步实验发现，PHB2 与 NOX1 的结合区域为 PHB2 的 N 端（1-150aa）与 NOX1 的 C 端（450-564aa），该区域包含 NOX1 的泛素化位点，PHB2 可能通过竞争性结合阻止 E3 泛素连接酶的识别。​

动物实验中，PHB2 过表达组的皮下肿瘤体积及重量显著大于对照组（P<0.01），腹腔转移结节数增加（P<0.01）；而联合 ML171 处理可显著缩小肿瘤体积（抑制率约 40%）并减少转移灶（P<0.01）。免疫组化显示过表达组肿瘤组织中 NOX1、p-ERK 及 Ki-67 的阳性率显著升高，ML171 处理后上述指标均降低，与体外实验结果一致。​

综上，本研究证实 PHB2 在胃癌组织中高表达且与不良预后相关，其通过与 NOX1 在胞质中相互作用，延缓 NOX1 的泛素化降解以增强其活性，促进胞质 ROS 产生并激活 ERK 通路，最终推动胃癌细胞的增殖、迁移及转移。这一机制不仅揭示了 PHB2 作为胞质信号调节因子的新功能，也为靶向 PHB2-NOX1 相互作用的胃癌干预策略提供了理论依据。实验中采用的 AbMole ML171 抑制剂凭借其高特异性和低毒性，为精准解析 NOX1 在信号轴中的作用提供了可靠工具，其在体内外实验中的稳定表现也验证了该试剂在肿瘤氧化应激研究中的适用性。