Withaferin A通过促进LCN2介导的星形胶质细胞极化抑制神经元铁死亡

越来越多的证据表明神经胶质细胞在癫痫发病中扮演重要角色，其中星形胶质细胞的激活在癫痫动物模型和患者脑组织中均被观察到。星形胶质细胞的 A1/A2 极化表型被认为与癫痫病理密切相关：A1 型星形胶质细胞具有神经毒性，可破坏离子和神经递质稳态，加剧神经元过度兴奋；而 A2 型星形胶质细胞则分泌神经保护因子，促进神经元存活。此外，神经元铁死亡作为一种铁依赖的脂质过氧化导致的程序性死亡方式，已被证实参与癫痫发病过程，铁死亡特异性抑制剂可逆转癫痫中的神经元丢失。

Withaferin A（WFA）作为一种从南非醉茄中提取的 C28 甾体内酯，已被证实具有广泛的神经保护作用，但其在癫痫中的作用及是否通过调节星形胶质细胞极化和铁死亡发挥效应尚未明确，这构成了本研究的核心出发点。​

本研究采用 KA 诱导的颞叶癫痫小鼠模型（体内）和 KA 处理的原代星形胶质细胞模型（体外），系统探究 WFA 的神经保护效应及机制。实验所用主要试剂包括：WFA、 kainic acid（KA，AbMole，#M6863）、LEV、PI3K/AKT 通路抑制剂 Wortmannin 和激动剂 740 Y-P、铁死亡抑制剂 Fer-1，以及各类检测试剂盒。其中，AbMole 提供的 KA 纯度高、生物学活性稳定，在体外星形胶质细胞激活模型（5nM 处理）和体内立体定位注射（50mM，5μL）中均能有效诱导癫痫相关病理改变，为实验的可靠性提供了保障。​

动物实验选用 6-8 周龄雄性 C57BL/6j 小鼠，随机分为假手术组、KA 模型组、KA+WFA（2mg/kg、4mg/kg）组、KA+LEV 组及相关 rescue 组，每组样本量根据实验需求设定（6-33 只）。WFA 和 LEV 于 KA 注射后第 3 天开始腹腔注射，连续 7 天；外源性 LCN2 蛋白通过侧脑室注射给予。细胞实验中，原代星形胶质细胞取自新生小鼠皮层和海马，经 0.25% 胰酶消化后接种，采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养，待融合度达 75-90% 时进行处理，分组包括对照组、KA 处理组（5nM）、KA + 不同浓度 WFA（1nM、10nM、100nM）组，以及通路干预组（联合 Wortmannin 或 740 Y-P）。​

为评估 WFA 对癫痫发作的影响，采用脑电图（EEG）记录小鼠自发发作次数和持续时间，发现 KA 模型组在第 7 天和第 14 天的发作指标显著升高，而 WFA 处理以剂量依赖方式降低这些指标，4mg/kg 剂量效果尤为显著，且优于 LEV 组。通过 Nissl 染色观察海马 CA1、CA3 和 DG 区神经元数量，结果显示 WFA 可减少 KA 诱导的神经元丢失，其中 CA1 区神经元存活率提升最为明显（假手术组约 800 个 / 视野，模型组降至 300 个，4mg/kg WFA 组恢复至 600 个以上）。​

行为学评估方面，Morris 水迷宫实验显示，KA 模型组小鼠在定位航行实验中寻找平台的潜伏期延长，探针实验中穿越原平台区域的次数减少，而 WFA 处理显著改善这些认知缺陷，4mg/kg 组的目标象限停留时间较模型组增加约 2 倍。Y 迷宫实验中，WFA 处理使小鼠自发交替率提升（模型组约 40%，10nM WFA 组达 65%），高架十字迷宫和旷场实验则表明 WFA 可缓解癫痫后的焦虑样行为，表现为开放臂停留时间和中央区域活动时间延长。​

分子机制探究中，转录组测序分析发现 WFA 处理后海马组织中 6 个星形胶质细胞标志物基因发生显著变化，其中 LCN2 的下调最为显著。进一步验证显示，TLE 患者和 KA 模型小鼠的海马星形胶质细胞中 LCN2 的 mRNA 和蛋白水平均显著升高，而 WFA 处理可剂量依赖性降低其表达（4mg/kg 组较模型组降低约 50%）。免疫荧光共定位显示 LCN2 主要表达于星形胶质细胞（与 GFAP 共标），其受体 24p3R 则在神经元和星形胶质细胞中均有分布，提示 LCN2 可能通过旁分泌方式作用于神经元。​

星形胶质细胞极化实验中，免疫荧光和 Western blot 结果显示，KA 诱导后 A1 型标志物 C3 表达上调、A2 型标志物 S100A10 表达下调，而 WFA 处理可逆转这一趋势（10nM WFA 使 C3 蛋白水平降低约 40%，S100A10 升高约 60%）。通路研究发现，WFA 可抑制 PI3K/AKT 通路的激活（p-PI3K 和 p-AKT 水平降低），而 740 Y-P（PI3K 激动剂）可阻断 WFA 对星形胶质细胞极化的调节作用，表明该通路参与了 WFA 的效应机制。​

铁死亡相关检测结果显示，KA 模型组神经元中 GSH 水平降低、MDA 含量升高，脂质 ROS（C11-BODIPY 染色）和 4-HNE（脂质过氧化标志物）积累，线粒体膜电位（JC-1 染色）下降，而 WFA 处理可显著逆转这些变化。通过星形胶质细胞 - 神经元共培养系统发现，过表达 LCN2 可抵消 WFA 对神经元铁死亡的抑制作用，而敲低 LCN2 或使用 Fer-1 则可模拟 WFA 的效应。体内实验进一步证实，外源性 LCN2 补充可逆转 WFA 对癫痫小鼠海马神经元铁死亡的保护作用，表现为 GSH/MDA 比值下降、4-HNE 上调及线粒体形态异常（电镜观察显示线粒体膜皱缩、嵴减少）。​

综上，本研究证实 WFA 通过抑制 PI3K/AKT 通路促进星形胶质细胞从 A1 型向 A2 型极化，减少星形胶质细胞中 LCN2 的表达，进而抑制神经元铁死亡，最终发挥神经保护作用。这一机制不仅揭示了 WFA 在癫痫中的潜在价值，还提示 LCN2 可能成为干预癫痫后铁死亡的新靶点。实验中使用的 AbMole 公司的 KA 试剂凭借其高纯度和稳定的生物学活性，为模型构建的可靠性提供了关键支持。