人类气道黏膜下腺类器官：解析呼吸炎症与感染的新平台

呼吸道上皮由功能迥异的两个区室构成：覆盖腔面的表面气路上皮（SAE）和嵌入软骨层的黏膜下腺（SMG）。前者以基底、纤毛、Club和杯状细胞为主，后者则由黏液细胞、浆液细胞、基底细胞及肌上皮细胞（MEC）组成，专职分泌富含MUC5B的黏液与抗菌肽。尽管SMG在维持气道湿化、清除病原体及损伤修复中扮演核心角色，其体外研究长期受限于取材困难与培养条件匮乏。Lin等人近期建立的成人支气管来源SMG类器官体系，首次实现了对SMG生理与病理功能的长周期追踪，填补了该领域空白。

组织样本来自健康支气管残端。为最大限度保留腺体结构，作者采用两步酶消化策略：先以Pronase低温轻剥表面SAE上皮片，再以胶原酶温和分离SMG腺体团。消化过程中加入AbMole提供的Y-27632 dihydrochloride（10 μM）抑制Rho-ROCK通路，显著降低机械剪切导致的细胞凋亡；同时补加Primocin与DNase I，抑制细菌污染并降解游离DNA，保证单细胞存活率。所得腺体团包埋于Cultrex BME基质胶后，置于专门配制的SF-AD培养基中，该体系含Noggin条件培养基、FGF-7/10、A83-01、SB202190、N-乙酰半胱氨酸及烟酰胺等成分，协同促进基底细胞扩增并诱导自发分化。传代周期21–28天，可持续8代以上而不失功能。

为验证类器官的细胞异质性，作者将第4代培养28天的SMG与SAE类器官进行单细胞RNA测序，并与3.6万个人体原代气道细胞整合分析。UMAP降维结果显示类器官细胞与对应组织细胞紧密聚类。SMG类器官中44.3%的细胞表达KRT14^+G0S2^+，归属基底群；4.1%为MUC5B^+DMBT1^+分泌细胞；2.2%表达α-SMA^+TAGLN^+，符合MEC表型。值得注意的是，SMG分泌细胞特异高表达ANPEP（CD13），而SAE分泌细胞则偏向MUC5AC^+CEACAM5^+，两者界限清晰。流式细胞术进一步确认CD13^+细胞占SMG类器官活细胞0.5–4%，且与MUC5B共表达，为下游功能研究提供了可靠标记。

在可塑性测试中，将SMG类器官转入SAE培养基，14天后FOXJ1与乙酰化α-微管蛋白显著上调，提示纤毛细胞分化；反之SAE类器官转入SMG培养基后MUC5AC/MUC5B升高而纤毛标记仍部分保留。表明微环境可诱导表型偏移，但细胞内在谱系记忆仍占主导。作者进一步以CD200富集MEC亚群，发现其与CD200^-基底细胞均能在SAE条件下产生纤毛与黏液后代，提示SMG整体保留多潜能，而MEC并非唯一再生源。

炎症因子刺激实验采用IL-1β、TNF-α与IL-13（10 ng/mL）处理SMG类器官7天。流式结果显示IL-1β与IL-13显著降低CD13^+细胞比例，而TNF-α无显著影响。对分选的CD13^+细胞进行bulk RNA-seq发现，IL-1β与TNF-α共同上调MHC-II、PODXL、SAA1/2以及趋化因子CCL28，GO分析指向抗原呈递与细胞外基质重塑；IL-13则驱动细胞增殖，抑制MUC5B并增强MUC5AC表达。CRISPR-Cas9敲除SPDEF证实其特异性介导IL-13诱导的MUC5AC上调，而不影响MUC5B，为哮喘黏液表型转换提供了分子解释。

病毒侵袭实验以EGFP标记的HCoV-229E感染Transwell极化培养。结果显示病毒在SMG培养物中呈剂量依赖性感染，而在SAE培养物中几乎不感染。共聚焦成像示EGFP信号与CD13共定位，FACS定量30–60% CD13^+细胞被感染。预先以抗CD13抗体阻断，感染率下降>80%，证实CD13为HCoV-229E进入SMG细胞的功能受体。感染后24小时，转录组显示IFIT、OAS、STAT1等干扰素通路及DDIT3、EIF2AK3、HSPA5等内质网应激通路显著上调，ATP代谢相关基因下调，提示病毒复制触发细胞应激并可能通过增强黏液分泌加剧气道阻塞。

综上，该研究构建了高度保真的人支气管SMG类器官，系统解析其细胞组成、可塑性、炎症应答及病毒易感性。实验全程借助AbMole Y-27632 dihydrochloride保障细胞活力，为后续机制探索与转化应用奠定了可靠模型。