26、酶实验技术与影响因素解析

酶实验技术与影响因素解析

1. 酶复性通用协议

Novex 公司提供的方案在很多酶实验中表现出色。不过，并非所有酶在经过电泳分离的严苛处理后都能成功复性，因此每种酶采用此类方法的适用性都需通过实验确定。

以下是 SDS - PAGE 后酶复性的通用协议：
1. 电泳结束后，将凝胶置于 100 mL 体积分数为 2.5%（v:v）的 Triton X - 100 蒸馏水溶液中，在室温下轻轻振荡浸泡 30 分钟。
2. 倒掉溶液，换为 100 mL 含有以下成分的水性缓冲液：1.21 g/L Tris 碱、6.30 g/L Tris HCl、11.7 g/L NaCl、0.74 g/L CaCl₂ 和质量分数为 0.02%（w:v）的 Brig 35 洗涤剂。将凝胶在该溶液中于室温下轻轻振荡平衡 30 分钟。倒掉溶液，再换为 100 mL 相同的缓冲液，在 37°C 下孵育 4 - 16 小时。

2. 凝胶电泳后酶活性检测方法

• 活性染色法 ：通过特定试剂使具有酶活性的蛋白在凝胶上显色。以人二氢乳清酸脱氢酶（DHODase）为例，它利用氧化还原辅因子泛醌催化二氢乳清酸转化为乳清酸。该酶活性可与硝基蓝四氮唑（NBT）或甲基噻唑基四氮唑（MTT）的还原反应偶联，形成深色的甲臜产物，甲臜产物会沉淀在凝胶上酶活性所在位置。如在人肝线粒体膜洗涤剂提取物的天然凝胶电泳中，用考马斯亮蓝染色会显示大量蛋白条带；而在含有底物的 NBT 溶液中浸泡后染色，只有一条深色条带代表具有酶活性的 DHODase。活性条带可从凝胶中切下进行进一步分析，如 N 端测序，或作为特定酶纯化方案的一部分，也可用于制备针对目标酶的