CD1d敲除猪模型揭示NKT细胞发育机制

CD1d的靶向破坏阻止猪体内NKT细胞发育

摘要

在缺乏自然杀伤T（NKT）细胞的基因工程小鼠中的研究表明，这些淋巴细胞在先天性和适应性免疫应答中均发挥重要作用。然而，由于小鼠与人类之间存在诸多差异，包括NKT细胞频率、亚群和分布的不同，限制了小鼠模型用于研究人类NKT细胞的应用价值。相比之下，猪与人类在代谢、生理和生长特征方面具有许多相似之处，且NKT细胞特性也较为相近，因此可能是更合适的模型。为此，我们分析了CD1d缺陷型基因修饰猪，该模型因缺乏CD1d而无法发育出表达半不变T细胞受体（TCR）的I型不变NKT（iNKT）细胞以及使用可变TCR的II型NKT细胞。通过流式细胞术和干扰素‐γ酶联免疫斑点实验对外周血进行分析表明，CD1d敲除猪完全缺失iNKT细胞，而其他白细胞群体保持完整。已有研究显示，CD1d和NKT细胞参与调控小鼠共生微生物群的组成。因此，我们也比较了表达与缺乏NKT细胞的猪之间的粪便微生物群谱。然而，两者之间未发现显著性差异。缺乏或表达CD1d的猪。我们的结果首次表明，在非啮齿类动物中敲除CD1d可阻止NKT细胞的发育。CD1d缺陷型猪应能为更精确地确定NKT细胞在人类免疫反应中的作用提供一个有用的模型。它们也有助于了解NKT细胞对商业猪健康的影响。

引言

CD1分子是一类高度保守的抗原呈递糖蛋白，可将脂质抗原呈递给CD1限制性T细胞。在人类中，CD1科包含五个成员（CD1A‐E），由CD1A-E编码（Park和 Bendelac 2000）。其中，CD1d因被发现是小鼠与人类之间唯一保守的成员而受到广泛关注，尽管小鼠具有两个CD1d基因拷贝（Park和Bendelac 2000）。CD1d分子主要存在于造血细胞类型上，它们将脂质抗原呈递给一种特殊的免疫调节性T细胞亚群，即自然杀伤T（NKT）细胞（Van Kaer等，2011）。NKT细胞包括两个主要亚群：I型和II型。大多数I型NKT细胞表达半不变的T细胞受体（TCR），被称为不变NKT（iNKT）细胞。它们还能对原型抗原α‐半乳糖基神经酰胺（α‐GalCer）产生反应。II型NKT细胞则利用寡克隆TCR库识别不同的抗原（Godfrey等，2010）。I型和II型NKT细胞均能对先天性和适应性免疫系统产生显著影响，主要通过迅速分泌促炎和抗炎细胞因子实现（Kumar和Delovitch 2014）。

缺乏Ja18 TCR片段或CD1d的小鼠分别缺少I型NKT细胞或同时缺乏I型和II型NKT细胞，这些研究表明NKT细胞既能促进也能抑制多种免疫反应。总体而言，小鼠NKT细胞似乎通过分泌抗炎细胞因子来抑制自身免疫反应[（Kumar和Delovitch 2014）]，并保护机体免受移植物抗宿主病的侵害（Pillai等，2007）；而其促炎反应则参与了针对肿瘤[（Robertson等，2014）]以及包括病毒性、细菌性、真菌性和寄生性病原体在内的多种病原体的保护性免疫[（Kinjo等，2013）]。此外，NKT细胞还加重了多种小鼠炎症性疾病模型的症状，如过敏性气道反应、肝炎、缺血‐再灌注损伤、结肠炎、镰状细胞病和动脉粥样硬化[（Van Kaer等，2011）]。此外，CD1d基因敲除（KO）小鼠的研究表明，NKT细胞在调控肠道细菌定植（Nieuwenhuis等，2009）以及控制αβ T细胞阴性选择的髓质胸腺上皮细胞发育中具有重要作用（White等，2014）。这些及其他研究支持NKT细胞可能在人类多种免疫反应中发挥重要作用。然而，由于小鼠与人类之间在NKT细胞频率、亚群、细胞因子分泌谱及组织分布模式等方面存在显著差异，基于小鼠的发现难以转化为人类应用（Bendelac等，2007；Van Kaer等，2011）。因此，迫切需要更合适的动物模型来阐明NKT细胞如何影响人类的免疫反应。当前论文描述了我们近期构建的CD1d基因敲除猪（Whitworth等，2014），该模型正是为此目的而创建。

猪的优势在于，与小鼠NKT细胞相比，猪和人类的NKT细胞在频率、组织分布和亚群方面更为相似（Artiaga等 2014；Thierry等 2012）。此外，与人类一样，猪表达所有五类CD1分子，每类均能够向CD1限制性T细胞呈递脂质抗原（Eguchi‐Ogawa等 2007）。因此，消除CD1d可能对猪的糖脂反应产生的影响与人类相似，而与小鼠不同。CD1d基因敲除猪将允许在一个在解剖结构、生理学、生长和代谢方面与人类高度接近的物种中评估NKT细胞的功能。此外，猪和人类之间的适应性和先天性免疫细胞亚群高度同源，这可能解释了为何这两个物种对许多相同的病原体均易感。这可能为更明确地界定哪些人类病原体受到NKT细胞免疫调节作用的影响提供机会。最后，缺乏CD1d的猪可为了解NKT细胞如何参与针对威胁商业养猪业的病原体的免疫。

材料与方法

Pigs

所有动物实验均按照密苏里大学和佛罗里达大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。国家猪资源与研究中心（NSRRC）利用 CRISPR/Cas9系统生成了携带不同CD1d基因靶向破坏的CD1d猪。对体细胞进行修饰后，通过体细胞核移植或直接编辑体外产生的受精卵实现基因改造，方法如先前所述（Whitworth 等人，2014）。所获得的突变体包括七头猪（158‐1、158‐4、158‐5、159‐1、159‐4、166‐1 和 167‐1），它们在两个等位基因上均存在不同的CD1d基因破坏，具体信息详见Whitworth 等人（2014）。这些猪此后统称为CD1d基因敲除（CD1d KO）。对照组样本来自NSRRC的两头猪，分别为携带非有害性CD1d突变的杂合子（166‐2）和纯合子（166‐3），以及四头CD1d完整的猪（164‐3、164‐6、164‐9 和 165‐1）。为了分析外周血NKT细胞，另从佛罗里达大学动物科学系维持的杂交猪群中采集了额外的野生型动物样本。

血液采集和制备

根据美国农业部法规、国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》以及所有相关的州和联邦法规及政策，血液样本通过颈静脉采集至涂有肝素钠的真空采血管（BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞）中。外周血单个核细胞（PBMCs）的分离采用Ficoll‐Paque™ PREMIUM（GE Healthcare Bio‐Sciences Corp.，乌普萨拉，瑞典）进行，方法如前所述（Artiaga 等，2014）。为了获得全血白细胞，将 200μL 全血与基于氯化铵的缓冲液孵育以裂解红细胞。

流式细胞术和试剂

使用BD Accuri C6流式细胞仪通过流式细胞术对全血白细胞中的免疫细胞群体进行表征。细胞悬液使用西格玛奥德里奇公司（密苏里州圣路易斯）的大鼠IgG进行Fc受体阻断，并用指定的荧光染料偶联抗体染色。抗体在 4 °C下孵育30分钟（表1）。为了鉴定iNKT细胞，使用抗CD3e标记的样本与负载了α‐半乳糖基鞘氨醇类似物PBS57的小鼠CD1d（mCD1d）四聚体试剂或未负载的四聚体共同染色。αβ T淋巴细胞亚群通过抗CD3e、抗CD8a和抗CD4进行鉴定。γδ T淋巴细胞通过使用抗CD3e和抗TCRd抗体对白细胞共染色来鉴定。调节性T淋巴细胞（Treg细胞）通过表面染色抗CD3e和抗CD4以及胞内染色抗FoxP3进行鉴定，具体操作按照 eBioscience（加利福尼亚州圣地亚哥）的FoxP3染色试剂盒说明书进行。B淋巴细胞和单核细胞根据表面染色抗MHC II类分子（MHCII）、抗CD172a以及胞内染色抗CD79a进行鉴定，具体操作按照BD生物科学（加利福尼亚州圣何塞）的Cytofix/Cytoperm试剂盒说明书进行。被鉴定为MHCII?CD172-CD79a?和MHCII?CD172?CD79a-的细胞分别归类为B细胞和单核细胞。粒细胞则基于细胞群体的大小和复杂性，在圈选总白细胞后加以区分。数据采用FlowJo软件（Treestar，加利福尼亚州帕洛阿尔托）进行分析。

IFNγ酶联免疫斑点试验

将外周血单个核细胞以每孔0.5和1 × 10⁶个细胞的浓度分别接种至已包被纯化抗IFNc抗体（P2G10，BD生物科学）的MultiScreen HTS板（Millipore，马萨诸塞州比勒里卡）中，每组设三个复孔，并加入或不加入来自多伦多研究化学品公司（加拿大安大略省多伦多）的1 μg/ml α‐GalCer。α‐GalCer储备液按先前所述方法配制（Artiaga等，2014）。将板在5% CO₂和 37 °C条件下孵育3天，随后使用生物素标记的抗IFNc检测抗体（P2C11）、链霉亲和素‐HRP以及BD生物科学提供的BD细胞因子ELISPOT AEC底物试剂盒检测IFNc的产生。显色后，使用自动ELISPOT读板仪（AID EliSpot高分辨率读板系统ELHR03）读取斑点。数据为以每个α‐半乳糖苷酰鞘氨醇刺激的三复孔中斑点的平均数 ± SEM/10⁵个活细胞表示，减去未刺激孔中计数的斑点数。

通过16S rDNA测序分析粪便细菌群落

通过16S rDNA测序分析粪便细菌群落组成，分别采集7头CD1d基因敲除猪和3头对照组猪（165‐1、166‐2和166‐3）在6–8月龄时的个体粪便样本。采样后立即冷冻粪便样本，并储存于-80 ℃。采用Yu和 Morrison（？2004）描述的RBB法提取样本中的DNA。简要而言，取0.25 g新鲜解冻的样本，在SDS存在下进行两轮珠磨处理。使用乙酸铵和异丙醇沉淀核酸。用蛋白酶K和RNase A去除蛋白质和RNA。使用QIAGEN DNA Mini Stool试剂盒（凯杰，美国加利福尼亚州瓦伦西亚）的离心柱纯化DNA。采用NanoDrop分光光度计（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定DNA含量。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性和大小。所有DNA样本均储存于-20 ℃，待进一步处理。

PCR扩增和MiSeq测序由MR DNA（美国德克萨斯州沙洛水）完成。使用27F/519R引物（Lane 1991）和HotStarTaq Plus Master Mix试剂盒（美国 Qiagen公司）对16S rRNA基因的V1–V3区域进行PCR扩增。正向引物包含一个8 bp条形码用于样本识别。扩增程序包括：在 94 °C下初始变性3分钟；28个循环：在 94 °C下变性30秒，在 53 °C下退火40秒，在 72 °C下延伸1分钟；以及在 72 °C下最终延伸5分钟。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。根据分子量和DNA浓度，将各样本等比例混合，然后使用Agencourt AMPure XP试剂盒（贝克曼库尔特，美国加利福尼亚州布雷亚）。使用MiSeq v. 3测序平台（因美纳公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）生成300 bp双端测序读长。序列通过MR DNA分析流程进行修剪和拼接。

微生物生态学定量分析（QIIME；v. 1.8.0）用于进一步的序列处理和分析（卡波拉索等人2010年）。在完成解复用和初步质量过滤后，使用 pick_open_reference_otus.py 脚本选取可操作分类单元（OTUs）。采用这种开放参考的OTU选取方案，将序列与 GreenGenes 参考数据库 [release 13_5 进行比对，并在97%相似度下聚类；未与参考数据库聚类的序列则进行从头聚类（de novo）。嵌合体通过 usearch [v. 6.1.544（埃德加2010年）] 使用 usearch61 选项去除。分类学注释使用 RDP 分类器（王等人2007年）完成。我们使用 filter_otus_from_otu_table.py 脚本（博库利奇等人2013年）对OTU进行二次质量过滤，阈值设为0.005%。core_diversity_analyses.py 脚本用于比较OTUs的相对丰度、计算α多样性的系统发育多样性指标，并构建基于未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）图（洛祖波内和奈特2005年）。

统计分析

流式细胞术和ELISPOT检测数据采用GraphPad Prism（Macintosh版6.0d，GraphPad软件公司，加利福尼亚州拉霍亚）中的非参数Wilcoxon U检验进行分析。OTUs的相对丰度通过方差分析并结合错误发现率控制进行多重比较。在最高稀疏化深度下，使用t检验比较不同处理组间的系统发育多样性指标。组内 UniFrac距离和组间UniFrac距离采用非参数蒙特卡罗检验进行比较（未应用邦弗罗尼校正）。当p或q值 <0.05时，认为数据具有显著性。

结果

CD1d缺陷型猪缺乏iNKT细胞

为了确定缺乏CD1d的猪是否无法发育出NKT细胞，使用流式细胞术比较了来自NSRCC和UF的7只CD1d基因敲除猪与15只对照组猪的外周血（PB），采用抗CD3e抗体和PBS57负载的小鼠CD1d四聚体?来检测猪的I型iNKT细胞（Artiaga等，2014）。其他样本使用未负载的CD1d四聚体进行染色，以确定非特异性四聚体结合的程度（图1a）。在CD1d基因敲除猪中未检测到iNKT细胞，而在NSRRC（0.11% ± 0.06）和UF（0.17% ± 0.04）的对照组猪中的iNKT细胞频率与先前报道的猪数据相似（Artiaga等，2014；Thierry等，2012）（图1a）。

我们还通过分析猪血液中是否存在a‐半乳糖神经酰胺（GalCer）反应性细胞来评估iNKT细胞。c‐ELISPOT检测是将每头猪的外周血单个核细胞（PBMCs）在有或无 a‐GalCer的情况下孵育3天。每个动物的a‐GalCer响应细胞频率通过减去未刺激孔中的斑点数来确定。所有对照组猪均检测到对a‐Gal‐Cer的反应。相比之下，CD1d基因敲除猪中未检测到高于基线水平的IFNc斑点（图1b）。综上所述，这些结果表明，遗传性缺乏CD1D的猪无法发育出iNKT细胞。

为了确定其他免疫细胞是否受到CD1D缺失的影响，我们通过流式细胞术比较了CD1d基因敲除猪与NSRRC对照猪的外周血（PB）中多种白细胞群体，包括传统型、调节性以及γδ T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（表2）。在所分析的非iNKT细胞群体中均未发现差异。这些结果表明，缺乏CD1d的猪仅表现为iNKT细胞缺陷，而其他免疫细胞群体未受影响。

CD1d缺乏对粪便微生物群的组成没有影响

从7只CD1d基因敲除猪和3只对照组猪的粪便样本中，我们从 512,662条经质量过滤的16S rDNA序列中鉴定出962个操作分类单元（OTUs）。CD1d基因敲除猪与对照组猪之间在OTU丰度上无显著差异（q= 0.815）。在其他分类学层级（门、纲、目、科、属）上也未观察到明显差异（数据未显示）。

使用系统发育多样性指标测量时，CD1d基因敲除猪与对照组猪的组内（a）多样性相似。稀疏曲线图（图2a）在视觉上显示了这一结果，并且在最高稀疏水平下进行统计检验时也证实了这一点（p= 0.916）。当使用未加权UniFrac距离测量组间（b）多样性并以 PCoA图可视化时，样本并未按CD1d基因敲除或对照处理分组（图2b）。支持这一视觉观察结果的是，组内处理距离与组间处理距离之间无显著性差异（p= 0.297）。使用加权UniFrac距离时结果类似（数据未显示）。综上所述，这些分析表明CD1d基因敲除猪与对照组猪之间的细菌群落在组成上没有明显差异，但我们的结论受限于小样本量。

讨论

我们的结果表明，猪的iNKT细胞发育依赖于CD1d。然而，猪的CD1d缺乏似乎并未影响其他免疫细胞群体，这与在CD1d和Ja18缺陷型小鼠中报道的结果一致（Cui等，1997；Mendiratta等，1997）。我们还比较了表达和缺乏NKT细胞的猪之间的粪便微生物群谱，因为在小鼠中已证明CD1d和NKT细胞参与调控共生微生物群的组成。例如，CD1d缺陷与黏附性细菌数量增加相关，这是由于小肠潘氏细胞中CD1d介导的抗菌肽释放功能缺陷所致（Nieuwenhuis等 2009）。我们通过16S rDNA测序未检测到猪的粪便细菌群落在组成上的差异。值得注意的是，在基于UniFrac距离的PCoA图中，粪便样本并未按CD1d基因敲除或对照组处理进行聚类。然而，在对小鼠粪便样本进行的类似分析中，Nieuwenhuis等（2009）发现样本明显按处理方式聚类，即使样本量较小（n= 5，每组分别用于敲除和野生型小鼠）。未来的实验应分析小肠而非仅粪便中的群落组成，因为敲除小鼠在小肠中对病原体定植更为易感（Nieuwenhuis等 2009）。

总之，CD1d缺陷型猪可能提供一种重要工具，用于研究NKT细胞在生物学上比小鼠更接近人类的物种中如何参与免疫反应。该模型对于确定NKT细胞在易感病原体与人类相似且具有人类NKT细胞特征的物种中对微生物免疫的意义可能特别有用。其他应用可能包括利用CD1d敲除猪来理解NKT细胞在肿瘤免疫、移植耐受、炎症性疾病和自身免疫中的作用。最后，CD1d缺陷型猪还可能提供有关NKT细胞对商业养殖猪免疫健康重要性的有用信息。