20、单分子技术在生物钟蛋白研究中的应用

单分子技术在生物钟蛋白研究中的应用

1. 单分子荧光显微镜技术

单分子荧光显微镜技术测量溶液中酶活性的尝试可追溯到1961年。当时，β - D - 半乳糖苷酶的单个分子被封装在含有荧光底物（6HFG）的硅油滴中，通过荧光测定法监测每个液滴中反应产物（6HF）的增加。此后，人们进行了许多测量单生物分子活性的尝试。

1995年，Xue和Yeung利用毛细管电泳和激光诱导荧光的灵敏检测方法，研究了乳酸脱氢酶（LDH - 1）单个分子的化学反应性差异。他们发现，天然LDH - 1的单个分子表现出高达四倍的活性差异，这表明酶分子群体中存在具有不同化学性质的结构变体（异质性）。

同年，Funatsu等人利用全内反射荧光（TIRF）显微镜和荧光标记的ATP，成功测量了单个肌球蛋白分子的ATP周转情况。他们将荧光（Cy5）标记的肌球蛋白头部S - 1片段固定在石英载玻片表面，使它们彼此之间保持至少几微米的距离，然后将荧光（Cy3）标记的ATP（Cy3 - ATP）应用于表面的S - 1。由于倏逝波从玻璃 - 水界面穿透到约100 nm的深度，只有表面的S - 1分子和蛋白质上或附近的核苷酸被选择性激发。这种局部照明技术使研究人员能够减少自由移动的Cy3 - 核苷酸和溶液中水的拉曼散射产生的背景荧光（噪声），并可视化单个分子的微弱荧光信号。在他们的研究中，实时直接观察到单个Cy3 - ATP与单个肌球蛋白S - 1分子的结合以及ATP水解后Cy3 - ADP从S - 1的解离。TIRF已成为监测单分子事件的强大而通用的工具之一。除了TIRF，落射荧光、共聚焦荧光和其他荧光方法也被用于单分子荧光成像。

然而，荧光方法也有一些缺点：
- 荧光标记影响分子性质 <