生物化学 PCR（聚合酶链式反应）引物 制造(固相磷酰胺化学法) & 购买 & 存储

引物（Primer）

• 引物（Primer）是一小段单链 DNA（通常 18~25 个碱基），与模板 DNA 的特定位点互补。包括：Forward Primer（正向引物）和 Reverse Primer（反向引物）。PCR工程中可为 DNA 聚合酶提供“启动点”，定义了 PCR 扩增产物的两端，控制扩增区域的长度和特异性。

特性	内容
类型	单链 DNA（通常为 18–30 个碱基）
序列来源	根据目标基因序列，在软件或数据库中人工设计
功能	提供起始位点，与模板 DNA 上特定区域互补，用于启动 DNA 聚合酶复制
合成方法	固相磷酸三酯法（Phosphoramidite 化学合成）

pcr引物制造

• PCR 引物（Primer）是实验中用于“起始 DNA 合成”的短链 DNA 分子。制造引物的过程本质上是化学合成寡核苷酸。PCR 引物由专门的核酸合成仪器制造，大致过程如下：

步骤 1：设计引物序列（人工）

你先根据目的基因，在电脑上设计出需要的 5’ → 3’ 的 DNA 序列，比如：

Forward：5’-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3’
Reverse：5’-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’

步骤 2：用“磷酰胺法”合成 DNA

• 从 3’ 端 → 5’ 端一碱基一碱基地拼出来的,每轮合成只加一个碱基，重复进行 N 轮（N = 引物长度）：

步骤	说明
① 固相支持物	通常用硅珠或树脂，固定第一个碱基的 3’ 端
② 活化	添加下一个磷酰胺单体（例如保护好的 dA、dT、dC、dG）
③ 缩合	用催化剂让新碱基接到前一碱基的 5’ 位上形成磷酸二酯键
④ 氧化	将磷三酯氧化成稳定的磷酸结构
⑤ 脱保护 & 洗脱	去除保护基团，从固相物中释放下来，得到引物

步骤 3：合成后纯化

• 为了得到高纯度引物，一般以下方法：

方法	说明	应用范围
脱盐	最基础，用于普通 PCR、成本低	实验室常规用途（如 HIV 检测）
PAGE	聚丙烯酰胺凝胶纯化，高分辨率	用于高精度分子克隆
HPLC	高效液相色谱纯化，杂质少	qPCR / 探针 / 高保真扩增

购买引物

• 从寡核苷酸合成公司定制购买：
  在线下单：输入序列、长度、纯化方式、规模（nmol 或 OD），约 1–3 天(和纯化方法有关)的合成周期，样品多以冻干形式寄出，实验室溶解使用（TE buffer 或无酶水）。

平台主页	平台名称	官网链接	平台特点
	Thermo Fisher（赛默飞世尔）	https://primer.thermofisher.cn/	Thermo Fisher（赛默飞世尔），这是全球领先的生命科学公司之一，其 DNA 引物相关产品和储存说明在科研中非常权威。
	金斯瑞（GenScript）	https://www.genscript.com.cn/	支持高纯度（PAGE、HPLC）
	上海生工（Sangon Biotech）	https://www.sangon.com/	支持常见病毒引物查询，DNA合成引物在线订购操作指南
	博奥生物（Biosune）	http://www.biosune.com/	响应速度快，支持当日出库；适合中等规模实验需求
	齐碳科技（Tsingke）	https://www.tsingke.com/	平台工具界面友好、下单流程清晰；性价比高，适合批量合成
	丁香通平台	https://www.biomart.cn/product/s?wd=%E5%BC%95%E7%89%A9	聚合信息
	Bioz 平台	bioz.com	聚合信息,PubMed 有引用

• GenScript、IDT、Sigma-Aldrich 更多相关链接：

  • http://www.solarbio.cc/products/show5850786.html

  • 对定制订单感兴趣？具有多达 96 个基因的 qPCR Ready 板：233 美元/板 https://sciencellonline.com/en/genes/index/index

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  • https://www.bioon.com.cn/reagent/list.asp?sortid=7&typeid=87

  • 首页 产品与服务 遗传学与基因组学 定制服务 个别基因的 qPCR 引物

引物存储

形式	推荐温度	说明
冻干粉	-20°C（可放冰箱冷冻室）	室温下短期（几周）没问题，但长期需低温保存
溶液形式	-20°C（长期）或 4°C（短期使用）	避免频繁冻融

溶剂	稳定性	说明
无RNA酶无菌水（ddH₂O）	稳定性中等	易受pH波动或杂质影响，不推荐长期存放
TE缓冲液（10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0）	最佳选择	Tris缓冲pH，EDTA螯合金属抑制核酸酶，但它可能影响某些酶反应（如酶切）

• 溶液状态下的引物更容易降解，分装后存储。一次性配成多个小管（Aliquot），每管仅包含1~2周使用量。工作浓度一般为10 微摩尔/升（10 μmol/L）。高频使用（如qPCR），可把部分溶液分装在 4°C 保存，几周内用完。

• 避免反复冻融，避免阳光直射，避免长时间室温放置：

储存条件	推荐保存时限
冻干粉，-20°C	≥ 2 年
溶液，-20°C	1~2 年
溶液，4°C	≤ 1 个月
溶液，室温	几小时以内（仅临时）