原代细胞培养注意事项

分享一些培养原代细胞的经验，以小鼠肺微血管内皮细胞为例，希望能够帮助大家排除一些雷区。

对原代细胞最直观的理解，就是不能无限传代下去，不论你是自己提取的细胞还是从试剂公司购买的细胞，都会建议你在P2-P3代完成实验是最好的。但是我们都知道，对于细胞实验的需求量，P2-P3代的细胞数量很难满足。所以，掌握提取和培养原代细胞的技巧，尽可能地让细胞的好状态多维持几代，对实验成败来说至关重要。

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1.  原代内皮细胞提取

1)  整个操作要在洁净通风的超净台下进行，所有的器材要高压消毒。

2)  根据BALB/c小鼠的体重，用10ml/kg 3%浓度的戊巴比妥钠麻醉；将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内，这一步不仅可以消毒，也可以让小鼠体毛浸湿，后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。

3)  用镊子轻轻挑起小鼠的心脏，装有PBS的注射器插入心尖，同时在右心耳处剪开一个小口，缓慢推动注射器，随着心脏的跳动，将体内的血液冲洗出来。

4)  取出小鼠的肺部组织，将肺组织切成小米粒样的大小，置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。

5)  将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中（培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面，4度过夜，小鼠处理前，将培养瓶放置培养箱中，使其温度恢复至37度），置于培养箱37度的环境下，消化4个小时。

6)  消化4小时后，加入RPMI 1640培养基（有10%血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子）10ml（第一次添加培养基，可以是正常培养时的2倍量），继续培养24小时（继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整）。

7)  24小时后，取出肺组织，镜下观察细胞状态，换液。

8)  原代细胞的提取和培养是很慢的过程，一般需等到24小时后，才能在镜下看到些许细胞群，一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。

9)  原代细胞2-3天换液一次，因为内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。所以，内皮细胞生长接近单层时就可以传代了，不要等到长得非常满。

2.  内皮细胞鉴定：可以做CD31和VEGF受体免疫荧光染色。

是建议大家，如果有条件的话，还是要从靠谱的公司购买需要的细胞。优点在于节省实验时间，而且公司会提供相应的细胞鉴定。而且从技术层面而言，公司提供的原代细胞确实会比自己提取的纯正很多。对于动物细胞而言，公司只会提供免疫荧光鉴定结果，不会有STR，这些材料都要保存好，很多投稿杂志都需要提供这方面数据。购买的细胞需要注意以下几点：

1.  收到细胞时，要镜下观察是否有污染情况；收到细胞的前几天，要做好各种倍数的镜下拍照记录，以防细胞出现问题后，可以跟公司很好地沟通。

2.  收到细胞后，不要马上处理。应置于培养箱中静置4h以上再操作。如果不着急，可静置过夜。

3.  细胞的第一次传代，一定要密度高一些传代，原代细胞传代密度低，很难长起来。建议1:2-1:3传代。

4.  原代细胞传代时（内皮细胞，贴壁为例），0.25%+0.53nM的胰酶消化，1ml消化液37度培养箱内消化30sec，再加入5ml培养基（正常消化贴壁细胞，我们使用胰酶和培养基的量是1:1，但是原代细胞必须用大量培养基中和胰酶）。

5.  原代细胞不建议冻存，因为冻存很容易复活不成功。如果要冻存的话，建议在P2或P3代冻存，冻存液中的血清越多越好，建议比例9（血清）:1（DMSO）。

6.  原代细胞复苏时，置于37-38度水浴融化细胞，并加入10ml培养液（正常贴壁细胞复苏时，也可以使用这种比例，复苏成活率会大大提高），离心重悬铺板。

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