【视频教程】小鼠脑微血管内皮细胞原代分离操作

【实验视频】小鼠脑微血管内皮细胞原代分离培养

主要试剂：

（1）DMEM培养基 （2）胎牛血清（FBS）（3）胰蛋白酶 （4）PBS（5）青霉素-链霉素溶液（100X） （6）DMSO （7） bFGF（8）牛血清白蛋白(BSA) （9）台盼蓝粉末（10）淋巴细胞分离液（11）红细胞裂解液

主要试剂配制：

（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，4℃冰箱保存。

（2）DMEM细胞生长培养液：临用前根据需要按体积比20%加胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，再加入100μg/mL的肝素钠和1ng/mL的bFGF，置于4℃冰箱保存。

（3）细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。

（4）BSA溶液：准确称取20g BSA固体，溶解于100mL去离子水中，过滤后置于4℃冰箱保存备用。

实验步骤

（1）C57小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)。
    （2）随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。
    （3）用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 ℃水浴消化1.5 h。
    （4）离心(1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液，加入20% BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4 ℃)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。
    （5）加入3 ml  2.5%胰酶消化液消化20min，加入等量含血清培养基终止消化，离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
   （6）离心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液。
   （7）加入DMEM完全培养液(含20% FBS)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。

注意事项

（1）取出大脑之后尽量去除大脑白质，留下灰质。

（2）第一次消化事宜用胶原酶消化消化1.5h，将组织吹散之后用20%BSA分离

（3）将分离后的沉淀用胰酶消化20min，此处不可再用胶原酶消化，不然无法得到细胞

（4）由于获取的组织比较少可以不用percoll分离，直接终止消化将细胞悬液用于后续培养即可。

细胞形态

脑微血管内皮细胞原代培养过程中，约24h即可贴壁生长，细胞呈长梭形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，5- 7d 70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型。

【泽平科技原代细胞培养实验外包服务】https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA5ODU4NDYyNA==&mid=2651661802&idx=3&sn=3732608b9bbc7a39be852dcc81885e60&chksm=8b76d4b5bc015da336ccf8098ca650721a64eb95b9389ffbebab544e436587790d530f02bb93&token=1471187891&lang=zh_CN#rd