qPCR技术发展史及最新进展

本文回顾了PCR技术从定性到定量的发展历程,重点介绍了从自显影PCR、定量竞争PCR到实时定量PCR(qPCR)的演变。qPCR通过荧光标记和实时监测,实现了核酸分子的高效定量,具有高精度、高灵敏度和操作简便等优点。文中还提及了qPCR在基因表达、疾病诊断和蛋白质检测等领域的应用,并展望了未来技术的融合与创新可能带来的新突破。

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   PCR技术自从1985年由Mullis发明以来,被广泛的应用到核酸分子的检测当中。但显然,只能定性分析而无法定量,成为困扰科研工作者的一大难题。仅仅在5年之后,就有了一些初步的尝试,并取得了不错的效果。

       Pang等人在采用了一种PCR后分子显像的方法来进行定量[1],将PCR的原料ATP用32P标记,掺入到产物中去,用自显影技术进行分析(Fig 1),其精度足以区分两倍浓度的差异。这种方法操作相对繁琐,且涉及放射性标记;另外,其检测方式仍稍显粗糙,仅考量条带的光密度值,属于半定量的范畴,同时还需要将扩增循环数控制在指数期(30个之内)。该方法尽管未得到广泛应用,但却迈出了突破性的一步。

<think>好的,用户想了解qPCR数据分析与绘图的方法,包括相关的软件工具。首先,我需要回顾一下已有的引用内容,看看有哪些信息可以利用。 引用[1]提到了一个专门用于qRT-PCR数据可视化的工具,叫quantitative real-time PCR Data Visualization,可能是一个有用的工具。引用[2]讨论了Origin软件对一列数据进行区间统计,并且提到一键出图,可能Origin也是一个选项。引用[3]和[4]主要讲SPSS在数据分析中的应用,虽然SPSS更多用于统计分析,但用户可能需要数据处理的部分,比如方差分析或回归模型。引用[5]提到了GraphPad Prism 8.2处理相对定量法的数据,并详细描述了扩增曲线和溶解曲线,这可能是一个重点推荐的软件,因为GraphPad在生物统计中很常用。 接下来,用户的问题涉及数据分析方法和绘图工具,需要分步骤解答。首先,应该介绍qPCR数据分析的基本步骤,比如数据预处理、Ct值获取、相对定量计算(比如ΔΔCt法)、统计分析和结果可视化。然后,针对每个步骤推荐相应的软件,比如Excel用于基础整理,GraphPad Prism和Origin用于高级绘图,SPSS和R语言用于统计分析。 需要注意的是,用户可能对各个软件的具体操作不太熟悉,所以需要简要说明每个工具的特点和适用场景。例如,GraphPad Prism适合生物医学研究者,操作直观;R语言适合需要自定义分析的用户,但学习曲线较陡。同时,要确保提到的工具都有引用支持,比如引用[1]、[2]、[5]提到的工具,以及引用[3]、[4]提到的SPSS。 此外,用户可能需要了解如何选择适合自己的工具,所以最后可以给出选择建议,根据用户的技术背景和需求来推荐不同的软件组合。例如,非编程用户可以选择GraphPad Prism和Excel组合,而需要高级分析的可能用R或Python。 最后,生成相关问题时要围绕qPCR数据分析的步骤、工具比较、统计方法、数据预处理等,确保问题覆盖用户可能感兴趣的后续内容。</think>### qPCR数据分析与绘图方法解析 #### 一、qPCR数据分析核心步骤 1. **数据预处理** - 检查扩增曲线和溶解曲线质量,排除异常样本(如非特异性扩增或引物二聚体)[^5] - 计算Ct值(阈值循环数),需确保实验重复的Ct值标准差小于0.5 - 使用$ΔΔCt$法进行相对定量: $$ \text{相对表达量} = 2^{-\Delta\Delta Ct} $$ 其中$\Delta\Delta Ct = (Ct_{\text{目的基因}} - Ct_{\text{内参基因}})_{\text{实验组}} - (Ct_{\text{目的基因}} - Ct_{\text{内参基因}})_{\text{对照组}}$[^5] 2. **统计分析** - 使用方差分析(ANOVA)比较多组间差异,或t检验比较两组差异[^3][^4] - 通过SPSS或R语言实现多重比较校正(如Bonferroni法) #### 二、常用软件工具对比 | 工具名称 | 功能定位 | 特点 | 适用场景 | |------------------|---------------------------|-------------------------------------------|---------------------------| | **GraphPad Prism** | 统计分析+绘图 | 拖拽操作,预设qPCR模板,直接生成柱状图+误差线[^5] | 生物医学研究者首选 | | **Origin** | 专业科研绘图 | 支持热图、三维曲面图,可自定义颜色和坐标轴[^2] | 论文投稿级图表制作 | | **R语言** | 编程分析+高级可视化 | 通过`ggplot2`包实现高自由度绘图,需代码基础 | 大数据量或复杂分析需求 | | **Excel** | 基础数据处理 | 快速计算ΔΔCt值,制作简单折线图/柱状图 | 初步数据整理 | #### 三、操作示例(以GraphPad Prism为例) 1. **数据输入**:将Ct值按实验组/对照组分列导入 2. **分析流程**: ```text Analyze → ΔΔCt Calculation → 选择内参基因 → 自动生成相对表达量 ``` 3. **绘图优化**: - 双击柱状图调整误差线类型(SEM/SD) - 使用`Appearance`选项卡添加显著性标记(*p<0.05, **p<0.01) #### 四、工具选择建议 - **非编程用户**:GraphPad Prism + Excel组合(覆盖90%基础需求) - **高阶分析需求**:R语言(`pcr`包)+ Adobe Illustrator(图表润色) - **工业级标准化流程**:Thermo Fisher Cloud平台(集成数据分析与质控)
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