氧化石墨烯在抗菌医疗涂层中的应用

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#氧化石墨烯 # 抗菌涂层 # 医疗器械 # 水凝胶 # 耐药性

抗细菌医疗器械的未来发展：氧化石墨烯的作用

摘要

临床当前抗菌涂层研究面临的一个挑战是需要减少耐药性细菌感染，这是植入物排斥和重复手术的主要原因。为了避免微生物附着和生物膜形成，已开发出用于医疗器械的涂层材料，但这些材料存在短期耐久性不足以及诱导细菌耐药性新机制等缺点。石墨烯基薄膜和水凝胶因其优异的机械、化学和热性能、高纳米颗粒吸附能力以及抗菌作用，可能成为下一代保护涂层。在这篇简短的评论中，我们将报告氧化石墨烯基涂层的最新进展。氧化石墨烯是石墨烯的一种水溶性衍生物，具有高载药量和与聚合物的良好相容性，可塑形为任意所需形状。本文还将讨论其在伤口愈合和组织工程中的最新应用，以及氧化石墨烯涂层在临床应用前存在的关键问题。

关键词 : 石墨烯氧化物抗菌涂层医疗器械薄膜水凝胶细胞毒性抗生素耐药性

引言

医院获得性感染被视为一个重大的健康挑战，是世界第六大死因，在发达国家的发生率为>15%。细菌可以附着在临床环境中存在的所有器械以及植入人体内的植入物上。微生物可形成对抗生素治疗和宿主免疫反应具有抗性的生物膜，并能从原发感染部位扩散至全身。生物医学装置的表面需要防止细菌附着，并在体内保持长期稳定性和抗菌作用in vivo。添加不影响本体材料特性的抗菌涂层，可预防细菌定植以及手术并发症。这些涂层必须具备两个主要特性：首先，需要具有抗菌机制以避免细菌附着和细菌耐药性发展；其次，涂层应保证长期作用。

自2004年发现已知最薄材料以来，石墨烯的许多衍生物（如多层石墨烯、氧化石墨烯（GO）和还原氧化石墨烯（rGO））因其机械和抗菌性能以及经济化生产而受到广泛关注。其中，氧化石墨烯（GO）具有可用于避免植入物相关感染的特性。氧化石墨烯（GO）是大规模合成石墨烯的前体，由单原子层构成，表面含有羧酸、环氧基和羟基。这些官能团赋予GO片层两亲性，能够同时发生氢键和疏水相互作用，从而在水中良好分散，并提供较大的表面积用于药物负载以及针对特定应用的基团功能化。氧化石墨烯水溶性使其可与聚合物混合用于水凝胶成型，并且通过表面基团，GO易于与金属离子（如广泛用于抗菌用途的银）形成复合物。官能团的存在在GO中引入缺陷，因而相对于石墨烯，其电、机械和热性能有所降低；然而，GO显著增强了聚合物的耐久性、柔韧性和强度。事实上，在大多数医学应用中，假体与周围患者组织之间实现快速热平衡对于达到快速且均匀的热平衡至关重要。

在本报告中，我们将重点关注用于医用涂层应用的固态氧化石墨烯基材料的研究，而关于石墨烯衍生物（如还原氧化石墨烯）或其他氧化石墨烯用途（如生物污染或工业环境）的抗菌活性研究已在近期的综述论文中进行了总结。相较于大量关于溶液中氧化石墨烯抗菌活性的研究，针对基于氧化石墨烯的材料的研究仍然较少；我们将讨论该领域中存在的关键问题，这些问题需在临床环境中广泛应用前得到解决。

医疗器械的抗菌策略

预防微生物在生物医学装置上的定植以及由此引起的生物膜形成，是减少手术并发症和降低大量使用抗生素导致细菌耐药性的关键策略。

为此，基体材料可以通过一层薄膜进行涂覆，该薄膜由一种不赋予器械机械性能但能够限制细菌定植的材料制成。设计抗菌涂层的主要策略包括抗菌药物释放（DR）、接触杀灭（CK）和抗黏附（AA）。简而言之，在试剂释放法中，涂层负载有通过扩散、侵蚀或水解随时间释放的药物。尽管这种释放是局部的并可最大程度减少全身性影响，但该策略受限于涂层中抗菌化合物储存库的容量。

在接触杀菌法中，细菌被暴露在表面的抗菌药物直接杀死，这些药物能够破坏细菌膜。

最后，抗黏附涂层试图利用非细胞毒性机制来阻止定植和生物膜形成的最初阶段：通过聚乙二醇和两性离子等分子抑制细菌非特异性或特异性黏附。

氧化石墨烯材料可以利用上述所有策略：氧化石墨烯已被用于与抗生素剂（如溶菌酶、银和壳聚糖）结合，或利用其内在抗菌效应来减少黏附并在接触后杀死细菌（见表1）。

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氧化石墨烯的内在抗菌特性

氧化石墨烯（GO）对微生物的抗菌效果已在文献中得到广泛研究，近期已发表多篇关于该主题的优秀综述。简而言之，关于GO抗菌效果的尺寸、横向尺寸、浓度和分散性依赖关系存在许多争议性结果。然而，目前似乎已确定的是GO具有三种杀菌或抑菌机制（如图1所示）。其中最常观察到的效果是GO尖锐边缘切割细胞壁，这被称为纳米刀或纳米刃效应。GO像刀片一样切割细胞膜，导致细胞内物质泄漏到环境中，从而通过机械作用杀死微生物，这与通常靶向特定代谢途径的传统药物不同。该机制可引起膜应力，实验研究和理论模拟均已证实这一点。除了边缘外，其他研究团队还证明，即使没有GO的角部结构，也能实现抗菌效果，并且GO的基面可通过破坏性提取膜脂质引发膜应力。

还发现氧化石墨烯会诱导氧化应激，干扰细胞代谢并导致细胞坏死/凋亡。该氧化过程既可以是ROS依赖性的，也可以是非依赖性的，其原因是细菌对石墨烯片层的化学还原作用。

最后第三种机制主要在溶液中的氧化石墨烯中观察到，而非涂层中，该机制基于将细菌与外部环境隔离：在包裹/截留机制中，片层在细菌表面形成一层覆盖层，使其与环境隔离，阻碍其增殖和营养物质消耗。这些机制不太可能诱导细菌耐药性，并且具有长期效果，因为它们基于机械作用，且不依赖于任何药物储库。

然而，氧化石墨烯的抗菌活性在很大程度上取决于其分散性以及基面和锋利边缘的可及性，即取决于涂层的制备方法。因此，每种由氧化石墨烯制成的材料都具有其独特的抗菌效果，且在溶液中对微生物和真核细胞进行的测试结果可能与固态氧化石墨烯的结果不同。2015年，Perreault及其同事对溶液中或表面的氧化石墨烯针对大肠杆菌的抗菌效果进行了直接比较。

本研究中，沉积在表面涂层上的氧化石墨烯片层的抗菌活性随着片层尺寸的减小而增强，而在溶液中则呈现相反的趋势。这种差异可归因于两种状态下不同的抗菌机制：在溶液中，较大的氧化石墨烯片更有利于捕获细胞；而当沉积在表面时，较小的片层会增加缺陷，从而增强氧化石墨烯介导的微生物氧化和膜损伤。在真核细胞中也发现了有争议的结果。例如，Major及其同事发现，氧化石墨烯聚电解质薄膜在血液接触后会引起强烈的凝血激活、显著的血小板消耗以及强烈的免疫反应。另一方面，当氧化石墨烯分散液与胎牛血清或血液接触时，会在氧化石墨烯片层周围形成蛋白冠，从而降低氧化石墨烯的溶血效应。这种对抗菌活性和细胞毒性效应对氧化石墨烯物理形态的高度敏感性，应在基于氧化石墨烯材料的临床应用之前加以控制。

氧化石墨烯抗菌涂层

针对医学应用而设计的用于测试抗菌活性的氧化石墨烯涂层溶液详见表1。这些涂层的抗菌效果可源于氧化石墨烯，也可来自嵌入的杀菌剂（通常是壳聚糖或银）与氧化石墨烯的混合物。在后一种情况下，氧化石墨烯通常用于增强机械性能和抗菌特性，或提高药物稳定性及材料中的分布。

已采用多种方法制备基于氧化石墨烯的涂层，包括旋涂和静电纺丝、真空过滤、化学镀、相转化、电泳沉积、水凝胶自组装/交联、湿化学还原、溶剂蒸发以及溶液浇铸法。有关合成方法的比较可参见一篇非常有趣的近期综述。

在大多数情况下，测试的微生物为S. aureus和E. coli，分别用于比较对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响。Carpio及其同事, 还研究了另外两个物种，即R. opacus和C. metallidurans，它们对环境有毒化合物具有抗性，且常见于高度污染区域。Papi等人还研究了对C. albicans真菌的影响。

2010年，利用纯氧化石墨烯材料进行的开创性研究在抗菌表面领域取得了突破。Hu及其同事制备了一种坚固且柔性的氧化石墨烯纸，并用空气中的大肠杆菌DH5α细胞对其进行测试。经过过夜培养后，由于氧化石墨烯引起的膜破坏（通过扫描电子显微镜观察到），纸上未见细菌明显生长。由还原氧化石墨烯制成的纸对细菌的抑制效果较弱。本文中，对A549哺乳动物细胞的细胞毒性较轻，但实验是在氧化石墨烯溶液中进行的，未评估表面细胞生长情况。

另一项2010年的研究聚焦于电泳沉积在不锈钢上的氧化石墨烯。同样，在这种情况下，氧化石墨烯片层与微生物接触后导致细胞膜破裂，引发胞内物质外流和细胞死亡，尤其对单壁革兰氏阳性菌S. aureus更为明显。与Hu的研究相反，还原氧化石墨烯对细菌的抑制效果更强，这可能是由于还原氧化石墨烯更锐利的边缘与细菌细胞壁之间存在更强的相互作用，和/或细菌与还原氧化石墨烯片层边缘之间的电荷转移更有效。这些有争议的结果可归因于不同的制备方法以及对微生物暴露的边缘数量不同。

为了最大化氧化石墨烯平面的可及性，桑托斯和卡皮奥将其与低成本且易于生产的聚乙烯基‐N‐咔唑（PVK）聚合物混合。这种导电聚合物网络已在浮游细胞和生物膜上进行了测试，可沉积并图案化于任何基底上，并且即使仅含3%的氧化石墨烯含量，也对细菌具有接触杀灭作用。溶液中的PVK‐GO被证明对NIH‐3T3成纤维细胞无毒性。另一种用于增加表面氧化石墨烯边缘可及性的技术是激光超空化，帕皮及其同事在最近的一篇论文中利用了该技术。特别是，他们证明了由氧化石墨烯和琼脂制成的水凝胶作为抗菌（针对S. aureus和E. coli）以及抗真菌（针对C. albicans）材料的可行性。在此研究中，抗菌效能得益于氧化石墨烯刀片效应与通过激光诱导超空化印在水凝胶表面的Cancer Pagurus甲壳天然抗菌图案的结合。

在其他研究中，已将氧化石墨烯添加到聚碳酸酯和聚乳酸‐聚氨酯等材料中，以赋予和/或增强材料强度和抗菌性能。

氧化石墨烯基团和高比表面积使其能够很好地与生长因子、酶和药物进行功能化。一系列研究分析了氧化石墨烯在含有其他抗菌剂的材料中的作用（参见表1中的“联合策略”）。

氧化石墨烯‐聚乙烯亚胺（PEI）薄膜已合成用于组织工程。这些支架具有高度生物相容性，可诱导干细胞成骨作用、矿化，并促进成骨因子的吸附以增强分化。此外，氧化石墨烯‐PEI 能够杀死E.coli，这归因于氧化石墨烯边缘以及聚乙烯亚胺（PEI）的阳离子电荷对细胞壁脂质提取的协同作用。在后续研究中，还证明了其对S. aureus的杀菌能力。

在段及其同事的研究中，利用氧化石墨烯（GO）将溶菌酶（一种抗菌酶）固定在聚醚砜（PES）膜表面，并对大肠杆菌表现出70%的抗菌活性。

壳聚糖（CS）多糖已被用于不同研究中的涂层目的，主要因其具有优异的生物相容性、抗菌性和生物吸附性，尽管其稳定性和机械性能较差。2011年，斯里普拉萨德及其同事制备了一种发光、可图案化且具有抗菌性能的氧化石墨烯‐壳聚糖复合材料，可用于多用途应用。通过将天然乳铁蛋白‐金纳米颗粒嵌入材料中，实现了氧化石墨烯/还原氧化石墨烯薄膜的发光性，这些薄膜具有较大面积（cm²），且透明性可通过氧化石墨烯浓度进行调控。马扎赫里及其同事制备了一种对人骨髓间充质干细胞（hMSC）增殖高度兼容且同时对S. aureus具有抗菌活性的氧化石墨烯‐壳聚糖材料，在6%氧化石墨烯存在下，壳聚糖的抗菌效果略有增强（∼5%）。林及其同事开发了一种将氧化石墨烯和还原氧化石墨烯片层嵌入薄膜的方法。在该研究中，尽管氧化石墨烯更能改善壳聚糖薄膜的热学和拉伸性能，但还原氧化石墨烯对P. aeruginosa的抑制作用更为有效。

文献中最常与氧化石墨烯结合使用的化合物是银（Ag），其以多种形式广泛用作器械基底应用中的抗菌剂。与氧化石墨烯结合使用可降低银的团聚倾向，同时减少金属用量，特别是考虑到高剂量银具有细胞毒性。

在这方面，值得一提的是索鲁什的工作，其中银纳米颗粒被高效、均匀地负载在GO片上，并沉积为薄膜，该薄膜在水中离子释放7天后可再生。此外，扬科维奇及其同事开发了一种银‐羟基磷灰石(HAP)‐GO复合材料，适用于骨组织植入物，具有改善的热学和机械性能，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出强效的抗菌活性以及轻微的细胞毒性。

基于氧化石墨烯的抗菌材料的生物相容性测试

至关重要的是，氧化石墨烯‐基材料必须在同时评估细胞毒性和抗菌效果。石墨烯独特的表面化学性质会导致其与细胞和生物分子发生特异性相互作用，目前关于氧化石墨烯毒性的研究结果存在争议，这可能是由于所采用的合成方案不同所致。细胞毒性效应可通过与表面的直接接触而产生。事实上，对细菌细胞壁产生的类似效应（如切割、包裹和活性氧生成）也在精子上被观测到，表现出浓度依赖性效应，并在浓度高于100 μg/ml时显著影响存活率和运动能力。此外，涂层降解产生的材料可能在体内循环。还应考虑到，如果该涂层的最终应用方向是组织工程，则需要证明在基于氧化石墨烯的支架上具有良好的细胞生长性能。

少数研究报道，将材料溶解在溶液中时表现出轻微的细胞毒性，而不是分析涂层上的生长情况。在组织工程应用中，已对涂层上的细胞生长进行了分析。PLA‐PU‐GO纤维支架对直接接种在材料上的MC3T3‐E1细胞表现出无细胞毒性。尽管还原氧化石墨烯纳米片在0.1 μg/ml浓度下对人骨髓间充质干细胞具有细胞毒性，但壳聚糖‐氧化石墨烯和聚乙烯亚胺‐氧化石墨烯被证明是该细胞系的生物相容性支架。

在人体内广泛使用的植入材料钛上沉积的银‐羟基磷灰石‐氧化石墨烯涂层，已使用外周血单个核细胞（PBMC）进行了测试，PBMC是抵抗植入物的第一道免疫防御线。细胞存活率约为80%，这种细胞存活率的轻微下降在文献所用的标准表格中被认为不具有细胞毒性。

据我们所知，仅有两项研究报道了基于氧化石墨烯的材料的体内效应。2014年，范及其同事测试了一种氧化石墨烯水凝胶在伤口愈合应用中的体内效果。在他们的研究中，使用银‐氧化石墨烯水凝胶处理小鼠皮肤上的小型伤口，该水凝胶表现出金属对细菌的协同效应以及氧化石墨烯的作用，从而提高了水凝胶的拉伸强度和断裂伸长率。

谢还进行了体内测试，以证明经八钙磷酸盐生物矿化的氧化石墨烯‐壳聚糖支架的骨组织再生能力。该支架对包封牛血清白蛋白的骨形态发生蛋白‐2（BMP‐2）和银纳米颗粒均具有高吸附性，可用于诱导细胞生长和分化，同时获得抗菌活性。

五年展望: 石墨烯涂层

是有望为医疗器械市场大部分领域带来新解决方案的最热门技术之一。可以合理地认为，这种大规模且密集的实验研究将推动多种基于石墨烯的涂层原型实现有效优化，从而更容易进入市场。在未来几年中，石墨烯在医疗保健领域的潜在应用可能堪比过去几年银纳米颗粒的应用。根据透明度市场研究的数据，2014年全球银纳米颗粒市场价值为7.009亿美元，预计到2023将达到24.155亿美元。考虑到这些令人瞩目的数据，以及石墨烯相比金属纳米颗粒具有更安全的抗菌性能，工业格局在未来几年内几乎不会忽视这一技术。

将石墨烯用于涂覆医疗器械、植入物、导管和外科设备的一个根本优势与石墨烯生产成本密切相关。如今，新的合成技术可以以比以往便宜100倍的价格生产石墨烯，如果这一创新趋势持续下去，它可能成为发达国家的一种便捷的涂层材料。

在将氧化石墨烯应用于临床之前，需要解决若干实际问题。首先，氧化石墨烯涂层的耐久性，即其从薄膜中的泄漏及其在人体内的后续降解。氧化石墨烯具有优异的机械性能和抗腐蚀性能，然而，其体内长期效应in vivo应进行分析。碳基材料在自然界中广泛存在，我们的免疫系统已经学会如何感知并破坏它们，主要通过氧化反应。氧化石墨烯水溶性使其相比石墨烯更容易降解，但如果器械设计用于在人体内永久存在，则这一现象可能成为劣势。有趣的是，李及其同事已开发出一种时间可控的可生物降解氧化石墨烯衍生物用于生物医学应用。

一种有前景的、可替代氧化石墨烯且表现出良好效果和细胞相容性的材料是其还原衍生物rGO。通过紫外‐可见光诱导光催化将氧化石墨烯片层沉积在TiO₂薄膜上，使该TiO₂薄膜对大肠杆菌的抗菌活性提高了7.5倍。该技术还已被用于制备氧化石墨烯/ZnO纳米棒薄膜，并证明对病毒和寄生虫也有效。需要指出的是，氧化石墨烯还可通过与细菌相互作用或自发还原为rGO，这可能导致表面材料的可变的疗效。该领域还需进一步研究，以分析氧化中间体可能产生的基因毒性、体内降解的时间及其效应。

第二个主要问题是细菌对氧化石墨烯抗菌效果的不同敏感性。细菌已经进化出独特的细胞壁和防御机制以对抗外部试剂，尽管氧化石墨烯的作用主要是机械性的，且不易诱导耐药性，但对某些物种而言，甚至表现出氧化石墨烯无效，并在接触氧化石墨烯溶液后出现生长增强的现象。因此，进一步的分析应排除这种效应对于能够在医疗器械上形成耐药性生物膜的微生物的影响，或者alternatively，应考虑将氧化石墨烯与其他抗菌剂联合使用。

尽管仍处于起步阶段，但关于氧化石墨烯涂层的研究在对抗耐药性和反复发生的植入物感染方面，展现出具有长期作用、环境相容且低细胞毒性的策略前景。