携带 VEGF 质粒的祖细胞来源外泌体增强大段骨缺损中的成骨诱导和血管重塑

大段骨缺损的再生修复一直是人类面临的重大挑战，其核心难点在于新生骨组织中血管化的缺乏。传统策略主要通过将骨支架与种子细胞、生长因子相结合，来调控成骨与血管生成过程。然而，基于细胞的疗法存在诸多固有问题，如免疫原性、致瘤性、生物活性维持困难以及难以实现即时移植等。外泌体作为一种纳米级（50-200 nm）的细胞外囊泡，包含蛋白质、核酸、脂质等复杂成分，作为治疗性纳米颗粒在疾病干预中展现出诱人前景。同时，凭借优异的生物相容性和高效的细胞内化能力，外泌体在再生医学领域作为理想的药物 / 基因递送载体也具有巨大潜力。

本研究构建了一种无细胞的组织工程系统，以功能性外泌体替代种子细胞。通过 ATDC5 来源的外泌体包裹 VEGF 基因，构建基因激活的工程化外泌体。特异性的外泌体锚定肽 CP05 作为柔性连接子，将工程化外泌体纳米颗粒与 3D 打印多孔骨支架有效结合。研究结果表明，工程化外泌体同时发挥成骨基质和基因载体的双重作用，既能诱导间充质干细胞成骨分化，又能可控释放 VEGF 基因以重塑血管系统。体内评估进一步证实，工程化外泌体介导的骨支架可有效诱导大量血管化骨再生。本研究根据大段骨缺损血管化骨修复的需求，设计了特异性工程化外泌体，同时揭示了功能性外泌体在无细胞组织工程中的应用潜力。

传统组织工程由生物材料支架、种子细胞和生长因子三大基本要素构成，在诱导受损组织器官的再生修复中发挥关键作用。其中，种子细胞对于启动组织再生至关重要，但基于细胞的组织工程在临床应用中同时面临细胞来源与活性、免疫排斥、治疗周期长及成本高等一系列问题。因此，无细胞组织工程作为一种安全、有效且可即时应用的策略，在再生医学领域得到广泛探索。

基于细胞的疗法作为先进治疗策略，为一些重症疾病带来了希望，但尚未在临床中普及，细胞移植的安全性和有效性仍是关注焦点。治疗性细胞来源的外泌体含有多种功能性 microRNA、蛋白质和生物活性分子，能够调控细胞行为、激活信号通路，并直接参与疾病干预过程。更重要的是，外泌体本身并非真正的细胞，可有效规避基于细胞疗法的常规弊端，因此被认为是传统细胞疗法的替代方案，并应用于无细胞组织工程中。

前期研究已证实外泌体介导的无细胞骨再生可促进颅骨再生，本研究进一步探讨外泌体增强疗法在大段骨缺损中的潜力 —— 这类缺损若无骨细胞的增殖和内部血管系统的重建则无法修复。为满足上述需求，利用 ATDC5 来源的外泌体包裹携带血管内皮生长因子（VEGF）基因的质粒，构建特异性工程化外泌体。ATDC5 是一种软骨祖细胞系，已证实具有显著的成骨分化能力；VEGF 作为关键生长因子，在多种再生组织中可促进血管重塑。因此，设计的工程化外泌体具有成骨基质和基因载体的双重功能，有望增强大段骨缺损中的血管化成骨过程。

外泌体疗法主要通过静脉注射携带靶向分子的外泌体或利用干细胞的归巢效应实现，但静脉给药的功能性外泌体在缺损部位的积累量极少，还可能增加富血器官的阻塞风险。因此，本研究将工程化外泌体与聚己内酯（PCL）3D 打印多孔骨支架结合，以确保在局部缺损部位实现持续稳定的干预效果。PCL 作为 FDA 批准的可生物降解材料，因炎症和免疫反应轻微、生物相容性优良、降解产物无毒等特点，在骨组织工程中应用广泛。值得注意的是，工程化外泌体与 3D 打印支架之间建立灵活且特异性的连接，是实现有效局部干预的重要前提。已有研究报道，外泌体锚定肽 CP05（AbMole，M58139）可特异性结合 CD63 抗原 ——CD63 是外泌体表面富集的四跨膜蛋白，常作为外泌体标志物。因此，本研究采用 CP05 作为柔性连接子修饰 3D 打印支架，以提高工程化外泌体的接枝效率。构建的外泌体激活骨支架在体内具有诱导成骨分化和血管重塑的双重功能。

通过透射电镜观察，ATDC5 细胞来源的外泌体呈球形，直径约 100 nm。Western blot 检测到两种外泌体相关蛋白特异性标志物 CD63 和 TSG101。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，纳米级外泌体的粒径为 114.2±1.8 nm；动态光散射（DLS）分析显示，外泌体的 zeta 电位为 - 32.0±1.5 mV。流式细胞术验证了 CP05 外泌体锚定肽与外泌体的成功结合，结合效率高达 90.96%。

通过琼脂糖凝胶电泳验证 pEGFP-kozVEGF165（VEGF）质粒基因，主条带位于 2000 bp 至 3000 bp 之间，与设计片段一致。随后通过电穿孔将 VEGF 质粒包裹到外泌体中，生成基因激活的工程化外泌体。将工程化外泌体与大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）共孵育 24 h 和 48 h 后，发现随着培养时间延长，转染效率显著提高。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）管形成实验进一步证实，基因激活的工程化外泌体上清诱导的管形成数量多于单纯外泌体阴性对照组，且培养时间从 1 h 延长至 3 h 时，管形成数量进一步增加。此外，qRT-PCR 分析显示，实验组细胞内 VEGF 的相对表达量约为阴性对照组的 2800 倍；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测到分泌的 VEGF 蛋白浓度约为 10 pg/mL，而对照组未检测到分泌的 VEGF 蛋白。

3D 打印支架呈现微米级多孔结构，孔径约 250 μm，该结构模拟骨小梁，有利于营养物质和氧气的交换及新生血管的形成。3D 打印 PCL 支架的抗压强度为 4.8±0.6 MPa。通过 1,6 - 己二胺在 3D 打印支架表面引入带正电荷的胺基（-NH2），X 射线光电子能谱（XPS）结果清晰显示，胺基修饰的 3D 打印 PCL 支架出现氮峰；茚三酮显色实验也显示胺基包覆前后颜色发生明显变化，这些结果均证实胺基成功包覆在 3D 打印 PCL 支架表面。为维持工程化外泌体与 3D 打印支架之间稳定灵活的连接，采用 CP05 外泌体锚定肽修饰 3D 打印支架。结果显示，胺基修饰的支架（PCL NH2+）对 CP05 的吸附量远高于未胺基修饰的支架（PCL NH2-）。将 CP05 与 Alexa Fluor 488 偶联，通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现，CP05 在 PCL 支架上的接枝效率为 26.7%（wt/wt）。

3D 打印 PCL 支架经 CP05 锚定肽修饰（PCL-CP05）后，对工程化外泌体的亲和力高于未修饰 CP05 的对照支架。CCK-8 assay 结果显示，同一时间点不同组之间无显著差异；支架表面能够支持细胞黏附和铺展，表明 3D 打印 PCL 支架具有良好的生物相容性。工程化外泌体在 PCL 支架上的接枝效率为 41.7%（wt/wt）。细胞摄取实验显示，大量 DiI 标记的外泌体被内化并分布在 rBMSCs 的核周区域。

碱性磷酸酶（ALP）染色常作为成骨分化的早期标志物，第 7 天各组 ALP 染色无明显差异；但第 14 天，外泌体组和工程化外泌体组的茜素红染色均显示明显的矿化结节，且成骨标志物骨钙素（OCN）的免疫荧光染色呈阳性。qRT-PCR 结果进一步表明，第 7 天 ATDC5 来源的外泌体和包裹 VEGF 的工程化外泌体均能在一定程度上促进 rBMSCs 成骨分化，其中 ALP 和 Col1a1 的表达水平在受外泌体介导的培养中显著上调，而 Runx2 和 OCN 在 ATDC5 来源的外泌体与包裹 VEGF 的工程化外泌体之间无显著差异。这些结果表明，ATDC5 来源的外泌体可增强成骨能力，而引入 VEGF 的工程化外泌体并未明显影响其成骨倾向。

利用大鼠桡骨缺损模型进一步研究基因激活的工程化外泌体在体内的作用。植入后 12 周，支架与原生骨组织融合，支架孔隙中填充大量新生组织，且由于新生骨的形成，植入的 PCL 支架抗压强度显著增强。三维重建显微 CT 图像显示，6 周和 12 周时实验组的骨再生情况明显优于其他组，尤其在 12 周时，仅实验组生成大量新骨。对显微 CT 图像的定量分析（包括骨体积（BV）、骨组织体积与总体积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th））与三维重建结果高度一致。

HE 染色显示，支架植入终点 12 周时，实验组存在大量新生骨组织，并观察到多个血管；对照组支架主要填充疏松结缔组织，含随机排列的低密度胶原纤维和血管。Masson 三色染色进一步显示，与对照组相比，实验组存在更多成熟胶原纤维。免疫荧光显示实验组血管生成标志物 CD31 呈阳性染色，这些结果充分证实，设计优良的工程化外泌体激活支架能够成功诱导血管化成骨。

无细胞增强疗法因其能够规避传统基于细胞疗法的固有问题（如细胞来源、免疫排斥、治疗周期长及成本高等）而受到广泛关注。无细胞疗法的最新进展凸显了外泌体作为功能性细胞替代物的潜力。研究发现，间充质干细胞来源的外泌体在 3D 打印支架中可增强早期骨关节炎的线粒体生物发生；高脂饮食可改变内脏脂肪组织来源外泌体的 miRNA 谱，通过促炎 miRNA 加剧结肠炎严重程度；透明细胞肾癌患者来源的外泌体可将 miR-19b-3p 转运至透明细胞肾癌细胞，启动上皮间质转化，促进转移。ATDC5 软骨祖细胞系来源的功能性外泌体已被证实具有显著的成骨分化能力，且作为成熟细胞系，因其增殖迅速、培养稳定，在骨组织工程中应用广泛。因此，本研究尝试通过构建新型工程化外泌体，探索无细胞组织工程 —— 这些外泌体既可作为成骨基质，又可作为基因载体。研究结果显示，ATDC5 来源的外泌体具有与 ATDC5 细胞相似的成骨能力，可在体外增强 rBMSCs 的成骨分化。此外，为严格控制外泌体的质量和稳定性，采用统一的细胞来源、培养参数和基于超速离心的分离参数等方法。因此，功能性细胞来源的纳米级外泌体可作为无细胞增强疗法的替代生物活性分子。

血管化成骨在促进大段骨缺损再生修复中起关键作用，因为血管缺乏会导致大骨缺损严重坏死。VEGF 作为关键生长因子，被广泛用于诱导血管重建，但目前多数研究采用 VEGF 蛋白，存在易降解、半衰期短、系统毒性及成本高等问题。因此，本研究提出用 VEGF 基因替代 VEGF 蛋白。此外，外泌体作为优良的生物载体，在持续增强疗法中被用于递送多种基因和药物。本研究通过将 VEGF 基因包裹到天然祖细胞来源的外泌体中，构建新型工程化外泌体。转染工程化外泌体后，PCR 和 ELISA 检测均显示单纯外泌体与含 VEGF 的外泌体之间存在显著差异。结果证实，天然外泌体和工程化外泌体均可在相似水平上促进 rBMSCs 的成骨分化，表明引入 VEGF 不会影响天然外泌体的成骨分化能力。此外，在大鼠桡骨缺损模型中，与其他组（包括外泌体组）相比，工程化外泌体组的成骨效果最佳，表明工程化外泌体在体内可同时促进血管生成和成骨。因此，基因激活的工程化外泌体具有成骨基质和基因载体的双重功能。

3D 打印多孔骨支架有利于促进新组织长入，并为血管重塑提供三维空间。本研究认为，将纳米级外泌体与微米级多孔支架结合是重要前提，最终采用 CP05（AbMole，M58139）外泌体锚定肽作为连接分子，在工程化外泌体与 3D 打印多孔支架之间建立稳定灵活的连接。已有研究证实，CP05 是 CD63 特异性外泌体锚定肽，而 CD63 作为外泌体标志物，是外泌体表面富集的四跨膜蛋白，因此 CP05 为外泌体工程提供了直接有效的修饰、 cargo 装载和外泌体捕获方法。研究结果证实，CP05 修饰显著提高了工程化外泌体与骨支架之间的接枝效率。

CP05 | AbMole | CRHSQMTVTSRL

在大段骨缺损中，功能性外泌体的局部递送和可控释放是主要挑战。首先，工程化外泌体的局部干预可规避传统静脉注射的诸多障碍，如缺损部位积累不足及富血器官阻塞风险；其次，与静脉给药相比，通过定向移植局部释放功能性外泌体可大幅提高干预效率。本研究将工程化外泌体与 3D 打印骨支架结合，通过定向移植外泌体介导的骨支架实现局部干预。体内动物评估清晰显示，设计优良的支架可成功诱导血管化骨再生。