长链卷曲螺旋蛋白NECC2调节oxLDL诱导的内皮氧化损伤

氧化低密度脂蛋白（oxLDL）作为动脉粥样硬化的关键诱导因子，可导致内皮损伤，进而引发泡沫细胞积累、炎症反应和血管平滑肌细胞增殖等一系列病理过程。内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化发生发展的首要基础和初始步骤，因此，深入探究 oxLDL 诱导内皮损伤的分子机制，对于理解动脉粥样硬化的病理过程具有重要意义。

小窝（caveolae）是一种在多种细胞中存在的烧瓶状质膜内陷结构，在血管内皮细胞中尤为丰富。自小窝蛋白 - 1（Cav-1）被确定为小窝的主要标志物以来，越来越多的证据表明小窝在调节内皮囊泡运输和信号转导中发挥重要作用。在血管内皮细胞腔面膜上，小窝的数量及其相关蛋白 Cav-1 的水平会受到各种致动脉粥样硬化刺激的局部影响，从而促进 oxLDL/LDL 在动脉粥样硬化易感区域的浸润或摄取。已有研究显示，Cav-1 缺失的小鼠在动脉粥样硬化易感区域的 LDL 积累显著减少，且 Cav-1 介导的 oxLDL 摄取可导致内皮细胞凋亡，Cav-1 / 小窝被认为是连接内皮损伤与动脉粥样硬化的核心调节因子。除了小窝蛋白外，其他具有支架特性的蛋白也被证明是小窝处信号转导的重要组织者，因此，探索动脉粥样硬化内皮中小窝相关信号系统的分子组成至关重要。

神经内分泌长链卷曲螺旋蛋白 2（NECC2），也称为 Jakmip3，是一种主要在中枢神经系统和内分泌组织中表达的新型长链卷曲螺旋蛋白。已有研究证实，NECC2 分布于小窝中，在 PC12 细胞和脂肪细胞的细胞表面与 Cav-1 共定位，并且在 PC12 细胞中调节 NGF 介导的 TrkA 信号通路，在脂肪细胞中调节胰岛素信号，提示 NECC2 可能组织专门用于信号转导的膜微结构域。尽管先前的研究表明 NECC2 可能参与 PC12 细胞分化和脂肪细胞形成，但 NECC2 在血管内皮细胞中的作用和功能尚未阐明。近期，研究团队发现了一种新型异羟肟酸衍生物（命名为 YF-307），它可以抑制 oxLDL 诱导的 VEC 凋亡，结合小分子 YF-307 和微阵列分析，发现 oxLDL 显著上调 VEC 中 NECC2 的表达，而 YF-307 则表现出相反的效果，基于此，本研究进一步探讨了 NECC2 是否参与 oxLDL 诱导的 VEC 损伤和动脉粥样硬化的发展。

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在铺有明胶的 100mm 塑料培养皿中培养。HUVECs 在添加 10%（v/v）胎牛血清和 10IU/mL FGF 的 M199 培养基中生长，细胞在实验室中于 37℃、含 5% CO₂的 humidified 培养箱中维持。融合的 HUVECs 以每孔 1.0×10⁵个细胞接种于 12 孔板或每孔 2.0×10⁵个细胞接种于 6 孔板，实验使用的细胞传代不超过 5 代。

动物模型及处理选用 6-7 周龄雄性 apoE⁻/⁻小鼠，购自山东省药学科学院。小鼠在特定病原体 - free（SPF）环境中维持 12 小时光 / 暗周期，前两周给予标准饲料。为建立动脉粥样硬化模型，小鼠给予致动脉粥样硬化饲料（含 21% 脂肪和 0.15% 胆固醇）16 周，然后随机分为五组。三组小鼠分别静脉注射 PBS（对照）、2.5mg/kg/ 天或 12.5mg/kg/ 天的 YF-307，持续十周；另外两组小鼠注射载体（100μL，PBS）和携带 NECC2 shRNA 的腺相关病毒血清型 9（AAV9）（2.0×10¹¹vgs），持续十周。注射后通过颈椎脱位处死小鼠，解剖主动脉根部并包埋在最佳切割温度（OCT）包埋介质中，用于组织学和免疫荧光测定。

细胞转染时，将 50%-60% 汇合度的 HUVECs 用 NECC2 或 scramble siRNA 以 20-80nM 转染 24 小时。孵育 6 小时后，移除转染培养基，更换为新鲜的正常生长培养基 24-48 小时。通过蛋白质印迹法确定 RNA 干扰效率（补充图 2A 和 2C），在后续敲低实验中选择 40nM 的 NECC2 siRNA。人 NECC2 过表达质粒插入 pcDNA3.1 载体。对于 NECC2 过表达，培养的原代 HUVECs 转染 72 小时。通过蛋白质印迹法确定质粒过表达效率（补充图 2B 和 2D），在后续过表达实验中选择 4μg pcDNA-3.1-NECC2，以空载体作为对照。

intracellular ROS 测量时，将不同处理的 HUVECs 与 10μM 的 2'，7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次以去除过量的 DCFH 探针。计数活细胞后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光强度，激发和发射波长分别为 488 和 525nm。

RNA 提取和逆转录（RT）-PCR 中，使用 Trizol 试剂提取总 RNA，通过测量 260nm 相对于 280nm 的吸光度确定 RNA 浓度。使用逆转录试剂盒将 2μg 总 RNA 逆转录为 cDNA。反应混合物（50μL）由 19μL 无核酸酶水、2.0μL cDNA、2.0μL（10mmol/L）每种引物和 25μL PCR Master Mix 组成。用于 NECC2 PCR 的引物序列为 5'-GTTCGAGGTGGAGAAGGTCA-3' 和 5'-GTCCGTCCTGTCTGTTTGGT-3'。扩增循环开始于 94℃变性 5 分钟，随后 35 个循环：94℃变性 30 秒，退火 30 秒，72℃延伸 10 分钟。通过实时 PCR 检测 NECC2 基因表达。20μL 反应混合物由 7.0μL 无核酸酶水、1.0μL cDNA（1mg/mL）、1.0μL 每种引物（10mM）和 10.0μL Maxima SYBR Green Mix组成。使用 CFX Connect 实时 PCR 检测系统执行 PCR 程序。使用 2-ΔΔCT 方法分析每个基因的相对表达。

Western blotting 中，1.0×10⁶个细胞在放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液中裂解。使用 BCA 蛋白测定试剂盒（AbMole）三次测量蛋白质浓度，样品上样到 10% SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质转移到 Millipore PVDF 膜上，在 5% 脱脂奶粉中室温封闭 1 小时，并在 4℃下与一抗孵育过夜。用 Tris 缓冲盐水 Tween 20（TBST）洗涤三次后，膜与抗大鼠 / 小鼠 IgG 孵育。用 TBST 洗涤膜三次，通过增强化学发光系统检测信号。

免疫共沉淀时，将 1.0×10⁶个 HUVECs 以 70% 汇合度转染 4μg 质粒。转染 24 小时后，用 PBS 缓冲液洗涤细胞两次。HUVECs 在 Western 和 IP 裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂Cocktail（Abmole Bioscience）中冰上裂解 5 分钟。细胞裂解物在 13,000rpm 下离心 15 分钟，部分上清液与连接抗 Tyk2 或抗 Cav-1 抗体的磁珠在 4℃下孵育过夜，剩余上清液用于输入组。将混合物与 Protein A+G 琼脂糖珠 在 4℃下孵育 2 小时。孵育后，用裂解缓冲液洗涤珠子五次，然后用 SDS 上样缓冲液煮沸 10 分钟。将免疫沉淀物用于标准免疫印迹分析。

Dil-OxLDL 摄取测定中，将 HUVECs（每孔 2×10⁵个细胞）接种到 6 孔板中，实验前用不同浓度的 YF-307 处理 24 小时。移除培养基后，用 PBS 洗涤 HUVECs 一次。然后将细胞与 40μg/mL DiI-OxLDL 在 37℃下孵育 4 小时。之后，细胞在含 100U/mL 肝素的 DMEM-BSA 中 4℃振荡洗涤 15 分钟，在含 4% 多聚甲醛的 PBS 中室温固定 10 分钟，并用 PBS 洗涤两次。最后，用荧光显微镜拍摄荧光照片。

免疫荧光染色时，不同处理后的细胞用 PBS 洗涤三次，用 4% 多聚甲醛在室温下固定 20 分钟。固定的细胞再用 PBS 洗涤，用 0.5% Triton X-100 通透 20 分钟。然后将通透的细胞用驴血清封闭 30 分钟，接着在 4℃下与指定的一抗孵育过夜，最后在暗处与荧光标记的二抗孵育 1 小时，用 DAPI 染色细胞核后，通过 ZEISS 共聚焦激光显微镜系统获取荧光图像。

凋亡细胞检测中，用 4% 多聚甲醛（AbMole）在 PBS 中固定 HUVECs。使用 TUNEL 试剂盒和 Hoechst 33258 按照说明书检测凋亡细胞。染色的细胞用 PBS 洗涤两次，然后拍照。通过 TUNEL 试剂盒检测动脉粥样硬化斑块内皮中的凋亡细胞。TUNEL 标记后，进行免疫荧光测定，使用 CD31 一抗和相应的二抗确定内皮，最后用 DAPI 复染细胞核以检测核。通过 ZEISS 共聚焦激光显微镜系统获取荧光图像。

组织学染色时，将 apoE⁻/⁻小鼠的整个动脉，包括主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉区域，纵向切开，固定，然后用 Oil Red O 染色以测量血管壁表面的脂质。然后将包埋在最佳切割温度 OTC中的小鼠心脏用冷冻切片机切成 7μm 切片。按照说明用苏木精和伊红（H&E）、Masson 染色或 Oil Red O 对冷冻切片进行染色。H&E 染色用于观察主动脉斑块的增厚；Masson 染色用于检测主动脉斑块的结缔组织；使用油红 O 染色观察主动脉斑块中的脂质积累。使用光学显微镜获取图像，并使用 Image Pro Plus 进行量化。

定量和统计分析中，结果表示为至少三个独立实验中一个代表性实验的三次重复样品的平均值 ±SD，除非另有说明。使用 GraphPad Prism 8.0 版通过两组中的双尾 Student's t 检验或三组中的单因素方差分析与 Tukey-Kramer 事后检验进行统计学显著性分析。所有体外实验至少进行 3 次独立重复，体内实验至少进行 8 次。P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。数据以 */#，/##，/### 和 ****/#### 分别表示 p<0.05，p<0.01，p<0.001，p<0.0001。

研究结果显示，NECC2 在 apoE⁻/⁻小鼠动脉粥样硬化病变的内皮和 oxLDL 处理的 HUVECs 中表达增加。为确定 NECC2 是否参与动脉粥样硬化的发展，评估了高脂饮食的 apoE⁻/⁻小鼠内皮中 NECC2 的表达，在正常饮食的 apoE⁻/⁻小鼠 VECs 中检测到低水平的 NECC2 蛋白，相比之下，随着斑块负荷的增加，在 apoE⁻/⁻小鼠的动脉粥样硬化内皮中观察到 NECC2 表达增加（图 1A 和 1B），然而，这些组之间血管中膜区域的 NECC2 蛋白水平没有显著差异。同时，分析了培养的 HUVECs 中 NECC2 在不同浓度 oxLDL 处理后的表达，基因表达结果和蛋白质印迹结果显示 oxLDL 显著增加 HUVECs 中 NECC2 mRNA 和蛋白水平（图 1C-1E）。

NECC2 促成 oxLDL 刺激的 HUVECs 和 apoE⁻/⁻小鼠动脉粥样硬化斑块内皮细胞的凋亡。VEC 凋亡是 VEC 损伤的主要形式，与动脉粥样硬化的所有阶段相关。在 oxLDL 处理的 HUVECs 中观察到核固缩和 TUNEL 阳性细胞等典型的凋亡特征，然而，通过 NECC2 siRNA 敲低 HUVECs 中的 NECC2 显著抑制了核固缩，并减少了 oxLDL 诱导的 TUNEL 阳性细胞数量的增加（图 2A 和 2C）。同时，在 NECC2 敲低的 HUVECs 中，oxLDL 不能降低抗凋亡蛋白 Bcl-2 水平或增加促凋亡蛋白 Bax 和 cleaved-caspase3 的水平（补充图 4B）。此外，通过尾静脉注射携带 NECC2 shRNA 的腺相关病毒血清型 9（AAV9）载体沉默 apoE⁻/⁻小鼠的 NECC2，注射十周后，处死小鼠以评估动脉粥样硬化斑块内皮的凋亡，与对照组相比，注射 NECC2 shRNA 的 apoE⁻/⁻小鼠的 TUNEL 阳性细胞数量减少，动脉粥样硬化斑块内皮中的 NECC2 水平降低（图 2E 和 2G，补充图 5A 和 5C）。

近期，研究团队发现了一种新型异羟肟酸衍生物（命名为化合物 YF-307），它可以显著抑制 oxLDL 诱导的 HUVECs 凋亡（图 2B、2D 和补充图 1 和 4A）。对用 oxLDL 或 oxLDL 和 YF-307 处理的 HUVECs 的微阵列分析显示，NECC2 是被 YF-307 最显著下调的基因（补充图 3A）。通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹分析证实了化合物 YF-307 对 NECC2 的下调（补充图 3B 和 3C），表明 YF-307 是下调 NECC2 表达的有效工具。此外，apoE⁻/⁻小鼠腹腔注射 YF-307 十周后，免疫荧光测定显示 YF-307 处理降低了 apoE⁻/⁻小鼠斑块内皮中 NECC2 的水平（补充图 5B 和 5D）。重要的是，TUNEL 染色结果显示 YF-307 处理抑制了斑块中血管内皮细胞的凋亡（图 2F 和 2H）。总之，这些结果清楚地表明 NECC2 在体外和体内均正向调节 oxLDL 诱导的 VEC 凋亡。

NECC2 参与 oxLDL 增加 HUVECs 和 apoE⁻/⁻小鼠动脉粥样硬化斑块内皮中 ICAM-1 和 VCAM-1 的水平。当血管内皮细胞损伤发生时，细胞分泌趋化因子，包括 ICAM-1 和 VCAM-1，它们将单核细胞吸引到内皮下空间，导致动脉粥样硬化的病理发展。蛋白质印迹分析结果显示，在 HUVECs 中通过 NECC2 siRNA 或化合物 YF-307 敲低 NECC2 显著抑制了 oxLDL 诱导的 ICAM-1 和 VCAM-1 蛋白水平的增加（图 3A-3D）。同时，免疫荧光染色表明注射 NECC2 shRNA 或 YF-307 抑制了 apoE⁻/⁻小鼠内皮中 ICAM-1 和 VCAM-1 的蛋白水平（图 3E-3J）。

下调 NECC2 限制 apoE⁻/⁻小鼠动脉粥样硬化的发展。通过检测一系列动脉粥样硬化指标，进一步检查下调 NECC2 是否影响 apoE⁻/⁻小鼠的动脉粥样硬化发展。在注射 NECC2 shRNA 或 YF-307 期间，每周记录小鼠的体重，这些组之间的体重没有明显差异（数据未显示）。整个主动脉的油红 O 染色图像和主动脉根部的 H&E 染色指数显示，与对照组相比，NECC2 shRNA 或 YF-307 可以减少动脉粥样硬化斑块区域（图 4A-4D）。此外，NECC2 shRNA 或 YF-307 显著减少脂质沉积，增加胶原蛋白含量和平滑肌细胞数量，并减少巨噬细胞面积，表明下调 NECC2 可以促进斑块的稳定性（图 4C、4D）。

NECC2 调节 Cav-1 Tyr14 磷酸化，是 HUVECs 中 oxLDL 摄取所必需的。NECC2 已被证实是一种小窝相关的卷曲螺旋蛋白，可在脂肪细胞中与 Cav-1 共免疫沉淀。在血管内皮细胞中，Cav-1 与 oxLDL 的内吞运输有关。最近的研究还表明，oxLDL 诱导的 Cav-1 Tyr14 磷酸化增加 oxLDL 摄取并促成 VEC 凋亡。免疫荧光测定结果显示，NECC2 和 Cav-1 共定位于细胞膜和细胞质中，并且在 oxLDL 处理组中这种共定位现象更明显（图 5A）。通过共免疫沉淀实验进一步证实了 HUVECs 中 NECC2 和 Cav-1 之间的相互作用（图 5B），在 oxLDL 处理的 HUVECs 中，与 Cav-1 相互作用的 NECC2 的量也增加。NECC2 过表达增加 Cav-1 Tyr14 磷酸化，并且通过 NECC2 siRNA 或化合物 YF-307 敲低 HUVECs 中的 NECC2 抑制 oxLDL 诱导的 Cav-1 磷酸化（图 5C-5F 和补充图 6）。此外，YF-307 处理或 NECC2 siRNA 显著阻断 HUVECs 中的 oxLDL 摄取（图 5G-5J）。

NECC2 通过 Tyk2 介导 Cav-1 磷酸化。上述结果表明 NECC2 正向调节 Cav-1 磷酸化，NECC2 也称为 Jakmip3，是 Jakmip 蛋白家族的成员。先前的研究表明，Jakmip1 可以与 Jak 蛋白（包括 Tyk2 和 Jak1）结合，并参与极化分泌和信号复合物的分离。在过表达 NECC2 的 HUVECs 中，敲低 Tyk2 但不敲低 Jak1 消除了 Cav-1 磷酸化（图 6A 和 6B）。同时，敲低 Tyk2 显著抑制 oxLDL 诱导的 Cav-1 磷酸化、oxLDL 摄取和 VEC 凋亡（图 6C、6D 和补充图 7）。共免疫沉淀实验证实 HUVECs 中 NECC2 与 Tyk2 相互作用，并且在 NECC2 过表达组中 NECC2 与 Tyk2 的相互作用显著增加（补充图 8）。此外，NECC2 的过表达增加 Tyk2 磷酸化，而敲低 NECC2 抑制 oxLDL 诱导的 Tyk2 磷酸化（图 6E-6H）。因此，这些结果表明 NECC2 激活 Tyk2，从而诱导 Cav-1 磷酸化、oxLDL 摄取和 VEC 凋亡。

NECC2 促成 oxLDL 诱导的 HUVECs 中 ROS 积累和 NF-κB 激活。oxLDL 诱导的过量 ROS 积累和 NF-κB 激活在 endothelial 细胞损伤和动脉粥样硬化中起重要作用。此外，oxLDL 诱导的 Cav-1 磷酸化反过来增加 oxLDL 摄取并激活 NF-κB。考虑到 NECC2 在调节 Cav-1 磷酸化中的作用，进一步检查了 NECC2 是否调节 oxLDL 诱导的 HUVECs 中 ROS 积累和 NF-κB 激活，结果表明，通过使用 NECC2 siRNA 或化合物 YF-307 敲低 HUVECs 中的 NECC2 显著抑制 oxLDL 诱导的 ROS 积累和 NF-κB 核转位（图 7）。

综上所述，本研究证实了内皮细胞 NECC2 在促进动脉粥样硬化发展中的重要作用。NECC2 位于小窝中，在正常血管内皮细胞中表达水平相对较低。oxLDL 诱导 NECC2 的过表达，从而促进相互作用蛋白 Tyk2 的活性，导致 Cav-1 Tyr14 磷酸化和 oxLDL 摄取。细胞内 oxLDL 的积累促进 ROS 积累并诱导 NF-κB 激活，从而加剧 VEC 凋亡和黏附因子表达，进而加剧动脉粥样硬化的发展（图 8）。