单细胞中的细胞判定法

细胞判定目前要解决两大问题，其一是如何过滤掉背景数据，其二是如何避免基因表达量（UMI）低的细胞类型被遗漏。

单细胞技术均采用Cell Barcode标记细胞，理论上，一条Cell Barcode对应一个细胞，但在细胞捕获与标记过程中，单细胞悬液中游离的“ambient RNA”（主要为细胞裂解后释放的RNA），也会被捕获和标记，这部分数据即被称之为背景数据，由于其表达模式相对平均，UMI数值比较低，很容易通过UMI数值将其过滤掉。

最初的细胞判定方法，主要根据UMI数值高低来判断，后续由于某些细胞的特殊性，增加了低UMI细胞的判定方法。目前细胞判定的方法主要有如下三种[1]：

• ① 高UMI阈值法[2]：这种方法即是通过UMI数值高低进行判断的方法。如果预期捕获N个细胞，则按照每个Barcode对应的UMI数进行排序，在UMI数最高的N个Barcode中，取第99分位Barcode对应的UMI数目除以10，作为cut-off。所有Barcode中对应的UMI数目高于该cut-off即为细胞，否则为背景。Cell Ranger2.2及以前的版本即采用这种方法。
• ② Knee Point方法[3]：这种方法使用UMI数值变化的“拐点”作为细胞判断cut-off的方法。将Barcode按照UMI数目从高到低排列，并拟合曲线，曲线斜率变化大的点对应的UMI数目为拐点，即cut-off。所有Barcode对应的UMI数目高于该cut-off为细胞，否则为背景。目前该方法应用较少。
• ③ EmptyDrop方法：这种方法解决了低UMI细胞与背景数据的区分，首先，对ambient RNA的集合进行估计，然后使用Dirichlet-multinomia模型，将其与每个Barcode对应的UMI count进行差异显著性检验，差异显著即为细胞，否则为背景。

对于高UMI的细胞，使用高UMI阈值方法和EmptyDrops方法可以判定出超过90%的细胞（图2红色方框内），Knee Point 方法仅能检出70%左右。对于低UMI的细胞，EmpotyDrops方法可以判断出约60%的细胞（图2蓝色方框内），其他两种方法几乎检测不到。

高UMI阈值方法能够确保高UMI细胞和背景数据的有效区分，EmptyDrops方法则确保低UMI细胞与背景数据的有效区分。因此，将EmptyDrops和高UMI阈值相结合，则可以兼顾细胞判定中背景数据和低UMI细胞漏检的问题。

参考文献：1. Lun, A.T.L., et al., EmptyDrops: distinguishing cells from empty droplets in droplet-based single-cell RNA sequencing data. Genome Biology, 2019. 20(1): p. 63.