单细胞测序最好的教程（二）：归一化

1. 背景

在前面的教程中，我们从数据集中删除了低质量的细胞，包括计数较差以及双细胞，并将数据存放在anndata文件中。由于单细胞测序技术的限制，我们在样本中获得RNA的时候，经过了分子捕获，逆转录还有测序。这些步骤会影响同一种细胞的细胞间的测序计数深度的变异性，故单细胞测序数据中的细胞间差异可能会包含了这部分测序误差，等价于计数矩阵中包含了变化很大的方差项。但在目前的统计方法中，绝大部分模型都预先假定了数据具有相同的方差结构。

伽玛-柏松分布

从理论上和经验上建立的 UMI 数据模型是 Gamma-Poisson 分布，即$Var[Y]=\mu +\alpha {\mu }^2$，其中$\mu$代表UMI平均值，$\alpha$代表细胞UMI的过度离散值。若 $\alpha =0$ 时，意味着此时UMI的分布为泊松分布。

“归一化”的预处理步骤旨在通过将“UMI的方差”缩放到指定范围，来调整数据集中的原始UMI计数以实现模型建模。而在真实的单细胞分析中，有不同的归一化方法以解决不同的分析问题。但经验发现，移位对数在大部分数据中的表现良好，这在2023年4月的Nature Method上的基准测试中有提到。

本章将向读者介绍两种不同的归一化技术：移位对数变换和皮尔逊残差的解析近似。移位对数有利于稳定方差，以利于后续降维和差异表达基因的识别。皮尔森近似残差可以保留生物学差异，并鉴定稀有细胞类型。

我们首先导入我们所需要的Python包，以及上一个教程分析所得到的anndata文件。

import omicverse as ov
import scanpy as sc

ov.utils.ov_plot_set()

adata = sc.read(
    filename="s4d8_quality_control.h5ad",
    backup_url="https://figshare.com/ndownloader/files/40014331",
)

try downloading from url
https://figshare.com/ndownloader/files/40014331
... this may take a while but only happens once

我们首先检查原始计数UMI的分布，一般在后续的分析中我们会忽略这一步，但对该分布的认识有利于我们理解归一化的意义。

import seaborn as sns
p1 = sns.histplot(adata.obs["total_counts"], bins=100, kde=False)

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2. 移位对数

我们将介绍的第一个归一化方法是基于delta方法的移位对数。Delta方法应用非线性函数$f(Y)$，使得原始计数 $Y$ 中的差异更加相似。

我们定义非线性函数$f(Y)$的变换如下：