20、脱细胞组织的制备、特性及应用

脱细胞组织的制备、特性及应用

1. 脱细胞方法

脱细胞过程通常由细胞破坏和细胞碎片清洗两个步骤组成。目前提出的脱细胞方法主要分为化学法和物理法。化学法能实现完美脱细胞，但会对细胞外基质（ECM）造成严重损伤；物理法脱细胞程度相对较低，但对ECM的损伤较小。由于组织类型多样，如基于细胞的组织、高细胞密度和基于ECM的组织、高ECM密度组织，且大小、厚度和体积各不相同，因此需要根据具体组织和使用目的选择合适的脱细胞方法。

• 化学脱细胞法 ：该方法因操作简便而成为主要方法。将组织浸入表面活性剂溶液、高渗和低渗溶液以及酒精等溶液中，然后清洗以去除细胞碎片和表面活性剂。脱细胞组织中残留DNA的量以200µg/mg组织为脱细胞标准。常用的表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠（SDC）和Triton X - 100等。SDS是最常用的洗涤剂，能有效脱细胞，但会严重损伤脱细胞基质（dECM），且具有细胞毒性，处理后需充分清洗。SDC和Triton X - 100表面活性较低，脱细胞作用相对温和，细胞毒性也低于SDS。不同表面活性剂组合使用可有效脱细胞，例如用SDS处理后再用Triton X - 100处理以去除残留的SDS。
• 物理脱细胞法 ：包括冻融法、高静水压法（HHP）和超临界法等。细胞破坏通常需要特殊设备，清洗过程中常使用核酸酶增强对细胞碎片中DNA和RNA的去除。冻融法需根据不同组织调整时间、温度和循环次数，一般循环次数增加，脱细胞效果增强。HHP法中，200MPa的静水压力可使细胞死亡，超过300MPa会导致蛋白质变性。脱细胞效果因组织而异，需调整压力、时间和温度等条件。细胞破坏后进行清洗，清洗时间与组织的大小、厚度和体积有关，深部组织的细胞碎片需长时间清洗。与表面活性剂脱细胞组织相比，物理法脱细胞组织的结构通常得以保留。

2. 脱细胞组织的特性

脱细胞组织的机械和化学特性因所用组织和脱细胞方法而异。一般来说，脱细胞会降低组织的机械性能，如弹性模量、拉伸强度和断裂应变等。机械性能的降低程度取决于组织类型和脱细胞方法。低细胞密度和高ECM密度的组织，如主动脉和真皮，相对能保留较多机械性能；而高细胞密度和低ECM密度的组织，如肺和肝脏，机械性能显著下降。此外，脱细胞方法对组织的化学特性，如ECM含量和变性程度，也会影响机械性能。表面活性剂脱细胞组织的机械性能低于HHP脱细胞组织，因为表面活性剂会去除胶原蛋白和弹性蛋白等结构ECM。除机械性能外，还需考虑渗透性、光学特性和肿胀特性等其他特性，以满足不同的使用目的。

组织类型	细胞密度	ECM密度	脱细胞后机械性能变化
主动脉、真皮	低	高	相对保留较多机械性能
肺、肝脏	高	低	机械性能显著下降

3. 脱细胞组织的应用

脱细胞组织可作为支架材料用于原位或异位组织再生。
- 原位应用 ：将与植入部位相同的组织进行脱细胞处理后原位植入，实现原位组织再生。
- 异位应用 ：
- 异位组织再生 ：使用与植入部位不同的脱细胞组织，在植入部位重建适合该部位的组织。脱细胞组织作为支架，周围细胞调节组织重建。
- 异位组织生成 ：将脱细胞组织应用于异位部位，由脱细胞组织衍生的组织在异位重新构建。研究发现，HHP法制备的脱细胞组织损伤较小，能维持与原始组织几乎相同的ECM结构，具有较高的组织重建能力。例如，将HHP脱细胞皮质骨碎片皮下植入大鼠体内，受者细胞渗入碎片间隙，形成骨样胶原基质，提示骨形成；将HHP脱细胞骨髓皮下植入小鼠体内，脱细胞后呈黄白色的骨髓再次变红，组织学检查显示类似活骨髓的结构，提示骨髓微环境在异位重建。

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    A(脱细胞组织):::process --> B(原位应用):::process
    A --> C(异位应用):::process
    B --> B1(原位组织再生):::process
    C --> C1(异位组织再生):::process
    C --> C2(异位组织生成):::process

4. 脱细胞器官

利用脱细胞器官进行器官再生研究，如心脏、肝脏、肺和肾脏等。由于脱细胞后仍可维持生物体的复杂形态和结构，通常通过血管网络灌注表面活性剂对连接大血管和毛细血管的器官进行脱细胞处理。脱细胞器官可直接植入体内，或在体外重新接种细胞后再植入。前者通过血液循环为整个器官提供营养和新细胞；后者通过大血管引入细胞，利用保留的血管网络将细胞分布到整个器官，并采用灌注培养技术。目前已有一些成功的器官重建案例，但仍存在一些问题，如再细胞化的脱细胞心脏尚未实现正常心脏功能。除诱导多能干细胞（iPS细胞）外，还在探索适合器官再细胞化的其他细胞来源，如体细胞干细胞、间充质干细胞等。同时，也在尝试大型动物的脱细胞器官研究，探索适合大尺寸器官的脱细胞条件和方法。

5. 脱细胞组织粉末的应用

脱细胞组织粉末称为dECM粉末，一些脱细胞组织产品以dECM粉末形式存在。dECM粉末适用于不规则形状的缺损部位，且因其含有多种生物活性物质，有望诱导组织再生。已对膀胱、小肠、肝脏、大脑和软骨等多种组织和器官的ECM粉末进行了研究。研究表明，dECM粉末植入体内后，可通过调节巨噬细胞极化，促进干细胞和祖细胞的适当浸润，从而调节炎症和组织再生。此外，dECM粉末还可作为生物墨水用于3D打印，通常需先进行溶解和凝胶化处理。

6. 脱细胞组织的功能化

为提高脱细胞组织的功能性，提出并研究了dECM凝胶和dECM复合材料。
- dECM凝胶 ：通过酶处理溶解dECM粉末，并将pH、盐浓度和温度调整到生理条件制备而成。与从动物组织中提取和纯化的单组分细胞外基质凝胶（如胶原蛋白）不同，dECM凝胶的成分和生物活性物质与原始组织相似，有望模拟体内环境。dECM凝胶可由多种组织和器官通过不同脱细胞方法制备，主要脱细胞方法为表面活性剂法，主要溶解方法为胃蛋白酶酶解。dECM凝胶在生理条件下（37°C，pH 7.4）孵育形成，其凝胶化速率和机械性能等物理特性取决于所用组织和脱细胞方法。研究表明，dECM凝胶的性能与脱细胞处理有关，不同弹性模量和来源组织的dECM凝胶对血管内皮细胞的行为有不同影响。dECM凝胶的应用广泛，包括可注射材料和3D打印材料等，但3D打印dECM凝胶仍处于基础探索阶段。

组织（浓度）	脱细胞方法	弹性模量（Pa）	凝胶化时间（min）
UBM（8mg/ml）	HHP	682 ± 50	26
UBM（8mg/ml）	洗涤剂	879 ± 91	71
SIS（8mg/ml）	HHP	1438 ± 122	26
SIS（8mg/ml）	洗涤剂	774 ± 135	61
胶原蛋白（3mg/ml）	-	1389 ± 36	45

• dECM复合材料 ：为进一步提高脱细胞组织的功能性，将其与生物活性物质、药物、人工材料等结合。例如，在脱细胞血管内皮侧固定肝素或特异性作用于血管内皮细胞的肽，以增加抗凝血性能；将药物封装的纳米颗粒固定在脱细胞组织上，通过药物缓释增加抗血栓性能。此外，还开展了脱细胞组织与人工材料复合的研究：
  • 开发具有生物相容性的人工材料与脱细胞组织复合的装置 ：以经皮装置为例，传统聚合物材料生物相容性低，易导致表皮脱落和感染。提出将具有生物相容性的脱细胞组织与聚合物材料在分子水平上部分整合的装置，如将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）与脱细胞真皮进行梯度渗透和聚合，制备梯度型PMMA/脱细胞真皮复合材料。该复合材料的应力 - 应变曲线显示，其性能与PMMA浓度有关，且在大鼠皮下植入后，脱细胞真皮部分与周围组织整合并出现细胞浸润，而PMMA部分无整合现象。
  • 开发小直径人工血管 ：研究发现，HHP法制备的脱细胞主动脉在组织结构、机械性能和渗透性方面优于SDS法，且具有高生物相容性。为将HHP脱细胞血管应用于异位部位，需考虑与目标血管的机械顺应性，采用混合血管技术，将脱细胞血管与合成纤维涂层和复合，以实现机械顺应性。例如，将脱细胞主动脉内膜 - 中膜制成内径为2 - 4mm的小直径脱细胞血管，通过静电纺丝将分段聚氨酯（SPU）包裹在血管周围，制备的混合血管的刚度参数（β）值与天然小直径血管相似。

综上所述，脱细胞组织在生物医学领域具有广阔的应用前景，但仍需进一步研究以优化脱细胞方法、明确组织再生机制，并开发更有效的功能化策略。

脱细胞组织的制备、特性及应用（续）

7. 脱细胞组织功能化的深入探讨

dECM凝胶和dECM复合材料的研究为脱细胞组织的功能化提供了新的思路和方法，但在实际应用中仍面临一些挑战和需要进一步研究的问题。

7.1 dECM凝胶的挑战与研究方向

虽然dECM凝胶具有模拟体内环境的潜力，但其物理特性的调控仍存在困难。不同组织和脱细胞方法制备的dECM凝胶性能差异较大，如何精确控制凝胶化速率、弹性模量等参数以满足不同应用需求是当前的研究重点。例如，在3D打印应用中，需要凝胶具有合适的流动性和固化速度，以保证打印的精度和结构稳定性。

此外，dECM凝胶中生物活性物质的释放机制和效果也需要深入研究。生物活性物质在凝胶中的分布和释放速率会影响细胞的行为和组织再生的效果。未来的研究可以探索如何优化凝胶的制备工艺，实现生物活性物质的可控释放。

7.2 dECM复合材料的挑战与研究方向

dECM复合材料在与人工材料复合时，界面结合的稳定性和生物相容性是关键问题。例如，在制备梯度型PMMA/脱细胞真皮复合材料时，需要确保PMMA与脱细胞真皮之间的良好结合，避免在使用过程中出现分离现象。同时，人工材料的加入可能会影响脱细胞组织的生物活性，如何在保证复合材料功能性的前提下，最大程度地保留脱细胞组织的生物活性是需要解决的问题。

另外，对于小直径人工血管的开发，除了机械顺应性，还需要考虑血管的长期稳定性和抗血栓形成能力。虽然通过与合成纤维复合可以改善机械性能，但如何进一步提高血管的抗血栓性能，减少血栓形成的风险，是未来研究的重要方向。

8. 脱细胞组织应用的未来展望

随着技术的不断发展和研究的深入，脱细胞组织在生物医学领域的应用前景十分广阔。以下是一些可能的发展方向：

8.1 个性化组织工程

利用患者自身的组织进行脱细胞处理，制备个性化的组织支架，可减少免疫排斥反应，提高组织再生的成功率。结合3D打印技术，可以根据患者的具体需求定制具有复杂结构和功能的组织支架，实现个性化的组织修复和再生。

8.2 多组织复合与器官构建

未来的研究可能会朝着多组织复合和完整器官构建的方向发展。通过将不同类型的脱细胞组织进行复合，构建具有多种功能的组织或器官，为器官移植提供新的解决方案。例如，构建包含血管、神经和实质组织的复合器官，以提高器官的功能和存活率。

8.3 药物递送系统

脱细胞组织可以作为药物递送系统的载体，实现药物的靶向递送和缓释。将药物封装在脱细胞组织中，通过其生物相容性和特定的结构，将药物精准地递送到病变部位，并实现药物的持续释放，提高药物治疗的效果。

9. 结论

脱细胞组织作为一种具有巨大潜力的生物材料，在组织工程和再生医学领域展现出了广阔的应用前景。通过化学和物理方法进行脱细胞处理，可以制备出具有不同特性的脱细胞组织，用于原位和异位组织再生、器官重建等多个方面。

dECM凝胶和dECM复合材料的研究为脱细胞组织的功能化提供了有效的手段，进一步提高了脱细胞组织的性能和应用范围。然而，目前仍存在一些挑战和问题需要解决，如脱细胞方法的优化、组织再生机制的明确、功能化策略的完善等。

未来，随着技术的不断进步和研究的深入，脱细胞组织有望在个性化组织工程、多组织复合与器官构建、药物递送系统等领域取得更大的突破，为生物医学领域的发展做出重要贡献。

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    A(脱细胞组织):::future --> B(个性化组织工程):::future
    A --> C(多组织复合与器官构建):::future
    A --> D(药物递送系统):::future

总结

• 脱细胞方法包括化学法和物理法，各有优缺点，需根据组织和目的选择合适的方法。
• 脱细胞组织的特性受组织类型和脱细胞方法影响，机械性能和化学特性是重要考量因素。
• 脱细胞组织可用于原位和异位组织再生，HHP法制备的脱细胞组织在异位组织生成方面具有潜力。
• 脱细胞器官的研究为器官再生提供了新途径，但仍面临一些挑战。
• dECM粉末和dECM凝胶、dECM复合材料的研究为脱细胞组织的功能化提供了方向。
• 未来，脱细胞组织有望在个性化组织工程、多组织复合与器官构建、药物递送系统等领域取得更大发展。

通过对脱细胞组织的深入研究和不断探索，我们有望开发出更加高效、安全、个性化的生物医学解决方案，为人类健康带来更多的福祉。