邻近标记技术PL-MS | 解锁泛素化“酶 - 底物”连接密码

引言

泛素化，作为真核细胞中最核心的翻译后修饰之一，就像一位 “蛋白命运调控师”—— 从蛋白降解、信号转导到 DNA 修复、细胞周期调控，几乎掌控着所有关键生命活动。但长期以来，研究者们始终被一个难题困住：如何精准捕获 E3 泛素连接酶和去泛素化酶（DUB）的 “直接搭档”—— 底物？传统方法要么混淆直接与间接互作蛋白，要么对低丰度底物束手无策。而邻近标记技术的横空出世，就像给研究者装上了 “分子显微镜”，让酶与底物的隐秘联系无所遁形。今天，我们就来系统拆解这项技术如何重塑泛素化研究格局。

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一、泛素化与去泛素化的核心逻辑

要理解邻近标记技术的价值，首先得摸清泛素化系统的 “基本盘”—— 毕竟找对靶标的前提是懂靶场：

▶泛素化：三级酶联的精准修饰

泛素（76 个氨基酸的小蛋白）通过 E1（激活酶）→E2（结合酶）→E3（连接酶）的级联反应，共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上。其中 E3 是 “底物筛选官”，人类基因组约有 700 种 E3，决定修饰特异性；泛素链类型决定功能（如 K48 型介导降解，K63 型参与信号转导）。

▶去泛素化：DUB 家族的平衡术

泛素化是可逆过程，DUB（去泛素化酶）通过水解异肽键移除泛素修饰，维持信号平衡。人类约有 100 种 DUB，分 7 个家族，同样具有底物特异性和泛素链偏好性，其活性异常与癌症、神经退行性疾病密切相关。

▶核心痛点

如何区分 “直接底物” 与 “间接互作蛋白”，如何高效捕获低丰度底物，是解析泛素化通路功能的关键瓶颈。

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二、核心技术：邻近标记的 “双王牌” 与拓展工具

邻近标记技术的核心思路的是：给目标酶 “绑定标记模块”，在细胞内原位标记其周围的底物蛋白，再通过亲和纯化 + 质谱精准鉴定。目前泛素化研究中，三大技术脱颖而出：

1. BioE3 技术：E3 连接酶底物的 “特异性捕获器”

由 Orhi Barroso-Gomila 团队在《Nature Communications（2023）》发表，专为解决 E3 底物鉴定的特异性难题设计：

▶核心设计：构建 “E3 连接酶 - BirA 生物素连接酶” 融合蛋白，同时在细胞中表达低亲和力标签融合的泛素类似物，确保标记仅发生在 E3 直接作用的底物上。

▶标记原理：细胞先在缺标记底物的培养基中培养，诱导融合体系表达后添加外源标记物，使泛素类似物在 E3 作用下，原位标记其直接底物，从源头避免非特异性结合。

▶技术优势：精准区分 E3 的直接 / 间接底物，对低丰度底物捕获效率高，适配 RING 型、HECT 型等多种类型 E3。

2. APEX2 近端泛素组学：DUB 底物的 “空间定位仪”

Andreas Damianou 团队在《Cell Chemical Biology（2025）》提出的技术，为 DUB 底物鉴定加上 “空间坐标”：

▶核心设计：将 APEX2 过氧化物酶与 DUB 融合，利用模块快速标记周围蛋白的特性，结合泛素残基富集技术，捕获 DUB 活性位点附近的泛素化底物。

▶标记原理：通过触发剂H2O2，使APEX2 在 30-40 秒内将生物素连接到周围蛋白的酪氨酸残基上，特异性标记 DUB 微环境底物；再通过链霉亲和素纯化 + 抗体富集，实现精准鉴定。

▶技术优势：兼具空间分辨率和时效性，能捕获动态互作的 DUB 底物，可监测药物或刺激依赖的 DUB 活性变化。

3. 其他拓展工具：适配更多场景

▶DUB 底物的系统性筛选 - bioUb 策略：通过 DUB 与邻近标记模块融合，在细胞内表达标记化泛素类似物，原位标记 DUB 底物，已用于 USP 家族 DUB 的大规模底物筛选，鉴定出包括转录因子、信号蛋白在内的多种特异性底物（Frontiers in Molecular Biosciences，2024》。

▶底物特异性验证技术 - MALDI-TOF 辅助验证：结合质谱技术（如 MALDI-TOF），快速验证邻近标记捕获的底物与目标酶的作用特异性，辅助排除非特异性结合蛋白，提升底物鉴定准确性（Nature Communications，2014》。

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三、案例实战：从 E3 到 DUB 的底物捕获故事

技术好不好用，实战见分晓。这些经典案例，完美展现了邻近标记技术的实力：

1. BioE3 揪出RNF4的SUMO依赖底物网络（Nature Communications，2023）

RNF4 是参与 DNA 损伤应答的 SUMO 靶向 E3 连接酶，Orhi Barroso-Gomila 团队用 BioE3 技术展开研究：

▶实验设计：构建野生型 RNF4、催化失活突变体、SUMO 结合基序突变体的邻近标记融合体系，在表达低亲和力标记泛素类似物的细胞中诱导；同时结合砷剂（诱导 DNA 损伤）和蛋白酶体抑制剂处理，模拟不同生理状态。

▶关键结果：鉴定出 188 个 RNF4 底物，其中 66% 为 SUMO 化依赖底物，涵盖 DNA 修复蛋白、PML 核体成分、细胞周期调控蛋白；砷剂处理后，已知底物 PML 显著富集，证明技术能响应 E3 酶活性的生理变化。

2. APEX2 解锁DUB-USP30 的线粒体底物鉴（Cell Chemical Biology，2025）

USP30 是线粒体定位的 DUB，参与线粒体自噬调控，Andreas Damianou 团队用 APEX2 近端泛素组学取得突破：

▶实验设计：将 APEX2 与 USP30 融合，在 HEK293 细胞中表达，用 CCCP（线粒体去极化剂）激活线粒体自噬，同时用 USP30 抑制剂阻断其活性，对比不同条件下的标记底物差异。

▶关键结果：不仅验证了已知底物 TOMM20、FKBP8，还发现新型底物 LETM1（参与线粒体离子转运和形态维持）；通过邻近标记实验和共免疫沉淀证实 USP30 与 LETM1 直接互作，USP30 抑制后 LETM1 泛素化水平显著升高。

3. E3 连接酶的跨界应用（Nature Communications，2023）

邻近标记技术可适配不同类型 E3，解决多样研究需求：

▶HECT 型 E3（NEDD4）：优化邻近标记体系，使用激活突变体和野生型泛素，鉴定出 59 个底物，多与囊泡运输、内吞作用相关，包括已知底物 EPS15 和新型底物 CCT8（分子伴侣复合物成分）。

▶细胞器特异性 E3（线粒体 MARCH5）：通过邻近标记捕获 MARCH5 的 27 个潜在底物，67% 为线粒体近端蛋白，验证 ARFGAP1 为新型底物，揭示 MARCH5 在 mitochondria-ER 串扰中的作用。

4. DUB-OTUB1 的底物网络解析（Frontiers in Molecular Biosciences，2024）

OTUB1 是 OTU 家族 DUB，研究者通过邻近标记结合 IP-MS：

▶实验设计：构建 OTUB1 与邻近标记模块的融合体系，在细胞中表达标记化泛素，对比 OTUB1 野生型与催化失活突变体的标记底物差异。

▶关键结果：鉴定出 OTUB1 的直接底物，同时发现其通过非经典机制（阻断 E2 ubiquitin 转移）调控的底物网络，为癌症中 OTUB1 的靶向干预提供靶点参考。

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四、邻近标记技术实现5 步解锁酶 - 底物网络

针对已知 E3 连接酶或 DUB，以邻近标记技术为核心的底物鉴定，可遵循以下通用研究思路，确保逻辑完整和结果可靠：

1. 目标酶与标记策略匹配：明确研究的 E3 或 DUB，根据其亚细胞定位（如核内、线粒体、细胞质）和酶活特性，设计适配的邻近标记体系，确保标记模块能在酶作用范围内高效原位标记底物。

2. 实验体系构建与优化：构建目标酶与邻近标记模块的融合表达体系，同时设计对应的标记底物（如泛素类似物）；验证体系有效性（如融合蛋白的正确定位、酶活性是否保留），排除标记模块对酶功能的干扰。

3. 原位标记与样品处理：在细胞中诱导融合体系表达，通过培养基调控（如添加 / 去除标记物）实现底物的原位标记；诱导特定生理状态（如药物处理、应激刺激）后裂解细胞，保留标记的酶 - 底物复合物。

4. 底物富集与质谱分析：利用标记物的亲和特性（如生物素 - 链霉亲和素）富集被标记的底物蛋白，结合泛素残基富集提升特异性；通过 LC-MS/MS 技术鉴定蛋白，采用定量方法（如标记定量、非标记定量）比较不同条件下的底物差异。

5. 候选底物筛选与验证：设定严格筛选标准（如底物在野生型酶组显著富集、在突变体组无富集，统计学显著），结合生物信息学分析（功能注释、互作网络）筛选候选底物；通过免疫印迹检测底物泛素化水平变化、共免疫沉淀验证酶与底物直接互作，功能实验（如酶敲低 / 过表达）确认底物的生理意义。

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结语：邻近标记技术引领泛素化研究新方向

邻近标记技术的崛起，彻底打破了泛素化研究 “酶易找、底物难寻” 的僵局 —— 它以 “原位标记、高特异性、低丰度捕获” 的优势，解决了传统方法的核心痛点，为解析泛素化通路的生理病理功能提供了核心工具。从 RING 型到 HECT 型 E3，从可溶性 DUB 到细胞器特异性酶，这项技术已覆盖泛素化研究的多场景需求，更推动了疾病靶向治疗的发展：为 PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）、DUBTACs（去泛素化酶靶向嵌合体）的设计提供精准底物 - 酶配对信息，助力开发更高效的疾病干预策略。

未来，随着邻近标记技术与单细胞质谱、空间蛋白组学的结合，我们将能捕捉更动态、更精细的酶 - 底物互作网络；而对于一线研究者，这项技术已成为解析泛素化 “密码” 的必备工具。泛素化研究的迷雾正在被技术驱散，更多生命调控的隐秘机制，等待我们用邻近标记技术一同解锁！

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▶精细化实验流程：提供细胞模型构建、诱导标记、生物素亲和富集、LC-MS/MS质谱检测等全流程服务，特别注重低丰度底物的捕获与假阳性控制。

▶底物深度分析与功能注释：不仅提供高置信度底物列表，还整合深度分析涵盖从功能富集、已知/新型互作标注，乃至通过多条件比较揭示动态变化的全链条解读。

▶验证支持：可提供后续实验技术支持，辅助完成从筛选到验证的完整证据链。

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参考文献

[1] Barroso-Gomila O, Merino-Cacho L, Muratore V, et al. BioE3 identifies specific substrates of ubiquitin E3 ligases. Nat Commun. 2023;14(1):7656. Published 2023 Nov 23. doi:10.1038/s41467-023-43326-8

[2] Damianou A, Jones HBL, Grigoriou A, et al. Integrative proximal-ubiquitomics profiling for deubiquitinase substrate discovery applied to USP30. Cell Chem Biol. 2025;32(5):736-751.e8. doi:10.1016/j.chembiol.2025.04.004

[3] Ritorto MS, Ewan R, Perez-Oliva AB, et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 2014;5:4763. Published 2014 Aug 27. doi:10.1038/ncomms5763

[4] Wu M, Sun L, Song T. OTUB1-mediated inhibition of ubiquitination: a growing list of effectors, multiplex mechanisms, and versatile functions. Front Mol Biosci. 2024;10:1261273. Published 2024 Jan 9. doi:10.3389/fmolb.2023.1261273

[5] Ramirez J, Prieto G, Olazabal-Herrero A, et al. A Proteomic Approach for Systematic Mapping of Substrates of Human Deubiquitinating Enzymes. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4851. Published 2021 May 3. doi:10.3390/ijms22094851