邻近标记技术的优势与局限性

在复杂而动态的细胞世界中，蛋白质、RNA等生物大分子间的相互作用构成了生命活动的分子基础，调控着细胞信号传导、代谢、基因表达等核心过程。然而，许多关键的相互作用是瞬时即逝、亲和力较低或发生在特定亚细胞结构的，传统研究方法如免疫共沉淀和酵母双杂交往往难以捕捉这种相互作用。如何才能在接近生理的条件下，精准捕获这些分子间的“亲密接触”，揭示其在特定时空的互作网络？邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术的出现，为解决这一核心科学问题提供了革命性的工具。

邻近标记技术的原理是：

在活细胞或组织内，通过将一个具有催化活性的酶（如生物素连接酶或过氧化物酶）与待研究的诱饵蛋白（或其他生物大分子）融合表达，该酶能够催化惰性的小分子底物转化为高反应活性的中间体。这些中间体由于寿命极短，只能在其产生位置扩散有限的距离，并与空间上邻近的生物大分子如蛋白质、DNA、RNA等发生共价连接，从而实现对诱饵蛋白邻近分子的标记。随后，通过亲和纯化和高灵敏度的质谱等技术鉴定被标记的分子，从而解析诱饵蛋白所处的局部微环境和动态相互作用网络。

邻近标记技术的一般流程：

1、构建与表达：将邻近标记酶的基因序列与编码诱饵蛋白的基因序列进行融合，构建重组表达载体。随后将该载体导入目标细胞系、原代细胞或模式生物中，使融合蛋白得以表达并正确定位到其生理相关的亚细胞位置。

2、标记反应：在融合蛋白表达并定位后，在特定条件下启动标记反应。对于生物素连接酶类技术，通常需要加入外源生物素并培养一段时间（BioID长达18-24小时，TurboID仅需10-30分钟）。对于过氧化物酶类技术，则需要短暂加入生物素-苯酚底物和H₂O₂（APEX2标记时间可短至1分钟）。

3、细胞裂解与富集：标记反应结束后，收集细胞或组织样品，在变性条件下（如含SDS的裂解液）进行细胞裂解，以充分释放被标记的蛋白质并破坏非共价的蛋白质相互作用，从而降低背景。随后，利用包被有链霉亲和素的磁珠或树脂特异性地捕获和富集被生物素标记的蛋白质。

4、鉴定与分析：将被富集的蛋白质进行酶切，产生的肽段通过高效液相色谱-串联质谱 技术进行鉴定和定量。最后，通过生物信息学方法对质谱数据进行处理，例如与对照组比较，筛选出与诱饵蛋白特异性邻近的候选蛋白质，并进行功能注释和相互作用网络构建。

邻近标记技术的优势：

1、捕获瞬时、微弱及低亲和力的相互作用

许多生物学上至关重要的蛋白质相互作用是动态且短暂的，或者其结合亲和力较低。传统方法如免疫共沉淀（Co-IP）通常依赖于相对稳定和较高亲和力的相互作用，在细胞裂解和多次洗涤过程中，这些不稳定的相互作用很容易解离而丢失。邻近标记技术通过酶催化的共价标记，将这种空间上的“邻近”关系不可逆地“固定”下来。即使原始的分子间相互作用非常短暂或亲和力不高，只要在标记反应发生时，目标分子处于邻近标记酶的有效标记半径之内，就有可能被成功标记并后续鉴定出来。这使得研究动态变化的信号转导通路、不稳定的多蛋白复合物的组装与解离等复杂生物学过程成为可能。

2、在活细胞或生理条件下进行原位研究

邻近标记反应可以直接在活细胞内或特定的组织微环境中进行，这最大限度地保留了生物大分子的天然构象、正确的亚细胞定位以及其所处的真实生理环境。与那些依赖于体外重组蛋白的相互作用研究或基于细胞裂解物的生化分析相比，邻近标记技术获得的结果更能反映生物分子在细胞内的真实状态和功能。例如，它可以用于研究在特定生理刺激（如药物处理）下，蛋白质相互作用网络的动态重塑。

3、提供空间邻近信息，超越直接相互作用的范畴

邻近标记技术不仅能够鉴定直接相互作用的蛋白质，更重要的是，它还能揭示在特定空间区域内共同存在的分子群体。这意味着它可以帮助我们理解细胞区室化的分子基础，例如特定细胞器的蛋白质组成，以及无膜细胞器的动态形成和成分。通过选择不同标记半径的酶，或者将酶靶向到亚细胞结构的不同区域，研究者可以探索不同尺度的空间邻近关系，绘制出精细的细胞内分子地图

4、适用于难溶性蛋白或特定细胞类型的研究

对于膜蛋白、细胞骨架蛋白等在传统生化缓冲液中溶解性较差的蛋白质，其纯化和相互作用研究一直是个难题。邻近标记技术由于是在原位进行标记，通常不需要对诱饵蛋白进行复杂的抽提和纯化步骤，因此为这些蛋白的研究提供了有效的途径。此外，通过结合细胞类型特异性的启动子、Cre-lox重组系统或靶向特定细胞表面标志物的抗体导向策略，邻近标记技术还可以实现对复杂组织中特定细胞类型的蛋白质组或其微环境的精准解析，这对于理解组织异质性和疾病机制具有重要意义。

邻近标记技术的局限性：

1、背景噪音与假阳性问题：

假阳性问题是邻近标记技术最主要的局限性之一，具体来自以下几个方面：

（1）非特异性标记：邻近标记酶的过量表达、标记底物浓度过高或标记时间过长，都可能导致酶催化的活性中间体扩散范围超出预期，或与非邻近的高丰度蛋白发生随机反应，从而产生非特异性标记。

（2）旁观者效应：邻近标记酶的标记半径内可能存在大量蛋白质，其中一些可能并非与诱饵蛋白发生功能相关的直接或间接相互作用，而仅仅是由于空间上的偶然共存而被标记，这些即为旁观者蛋白。

（3）内源性生物素化蛋白的干扰：在使用生物素作为标记物时，细胞内天然存在一些需要生物素作为辅基的酶，这些内源性生物素化蛋白会在后续的链霉亲和素富集步骤中被一同捕获，构成主要的背景干扰。

解决方法：设置严格的对照组，例如表达单独的邻近标记酶、表达与非互作蛋白融合的酶、或在不添加标记底物的条件下进行实验。仔细优化实验条件，包括融合蛋白的表达水平、标记底物的浓度和标记反应的时间。

2、潜在的细胞毒性与生理扰动：

邻近标记实验过程中的某些因素可能对细胞的正常生理状态产生不良影响：

（1）H₂O₂的毒性：APEX/APEX2技术依赖于外源添加H₂O₂作为酶促反应的共同底物。即使是低浓度的H₂O₂和短时间的处理，也可能对细胞造成氧化应激，干扰细胞内氧化还原平衡，甚至诱导细胞凋亡，从而影响实验结果的生理相关性。

（2）融合蛋白过表达的压力：高水平表达外源的融合蛋白本身就可能对细胞的蛋白质合成和折叠系统造成负担，干扰细胞正常的生理功能，甚至引发细胞的应激反应。

（3）底物或标记过程的潜在影响：长时间或高浓度的生物素处理，或者标记反应本身可能存在的蛋白质不稳定或自发标记问题，也可能对细胞的代谢或信号通路产生一些未知的干扰。

解决方法：对于APEX类技术，需要仔细优化H₂O₂的浓度和处理时间，以在保证标记效率的同时最大限度降低细胞毒性。使用诱导型表达系统来精确控制融合蛋白的表达水平和表达时程，进行必要的细胞活力检测和生理状态评估，优先选择那些已知细胞毒性较低的新型标记系统。

3、诱饵蛋白自身特性带来的影响：

将邻近标记酶融合到“诱饵”蛋白的N端还是C端，或者是否需要在其内部特定位置插入，都可能影响“诱饵”蛋白的正确折叠、亚细胞定位、稳定性或其原有的生物学功能。如果融合蛋白的定位错误或功能丧失，那么其标记的蛋白质谱将失去生理意义。此外，对于一些本身在细胞内丰度很低或动态变化非常剧烈的“诱饵”蛋白，其实验难度也会相应增大，可能需要更灵敏的检测手段或更精巧的实验设计。

解决方法：在构建融合蛋白时，尝试将酶融合到“诱饵”蛋白的不同末端或位置。通过免疫荧光显微镜等方法验证融合蛋白的亚细胞定位是否正确。通过功能回复实验等手段检测融合蛋白是否保持了原有的生物学活性。对于低丰度蛋白，可能需要富集特定细胞群体或亚细胞组分，或采用更灵敏的质谱技术。

总结：

邻近标记技术通过酶催化的原位共价标记策略，为研究活细胞内生物大分子的空间邻近关系和动态相互作用网络提供了一种革命性的方法。其核心价值在于能够捕获传统生化或遗传学方法难以检测的瞬时、微弱或低亲和力的相互作用，并且能够在接近生理的条件下进行研究，从而提供了宝贵的、具有空间维度信息的蛋白质组学数据。从最初的BioID到高效的TurboID、高分辨率的APEX2，再到精巧的光控系统，邻近标记技术的工具箱不断丰富和完善，其应用领域也从蛋白质互作扩展到RNA、DNA互作，乃至整个亚细胞结构的蛋白质图谱绘制。

然而，正如本文所描写，邻近标记技术并非没有缺陷，在使用过程中必须清醒地认识到其面临的挑战，包括潜在的背景噪音和假阳性问题、可能的细胞毒性与生理扰动以及诱饵蛋白自身特性可能带来的影响。只有充分理解这些优势与局限，才能更有效地驾驭这一强大工具。