LucettaTM 2 支原体检测

LucettaTM 2 Luminometer Convenient and Simple Mycoplasma Detection

简便的支原体检测

 

Lucetta™2发光计是一种单管发光计，用于检测生物发光和化学发光。 它既可以用作便携式电池供电的仪器，也可以与外部电源一起使用，适用于检测所有发光。 它采用特定模式进行设计，可用于Lonza的MycoAlert™支原体检测测定，也可用于许多其他基于发光的测定，例如细胞增殖和细胞毒性测定或荧光素酶报道基因测定。

 

优势

–小型便携式管式照度计

–无需PC的独立仪器

–高灵敏度和线性

–两种基本测量模式，包括一种用于运行MycoAlert™支原体检测测定的特定模式

–高数据存储容量，最大可存储多达2,000个单样本读数

–广泛的应用，例如 基于ATP的细胞增殖或细胞毒性测定或荧光素酶报告基因测定；

 

易于使用

–可用作便携式电池供电的发光计

–体积小，重量轻的仪器

–无需计算机

 

高灵敏度和线性

–检测不到3 fmol ATP

– 6个数量级的动态范围

 

两种基本的测量模式

–运行MycoAlert™支原体检测分析的特定模式

–快速单次读取模式，用于未处理的发光读数

 

高数据存储容量和PC上传选项

–内部存储器，最大可存储2,000个单个样本读数

–可选地通过Lucetta™Connect软件将样品结果传输到PC，以在Microsoft®Excel中查看和分析结果

 

应用范围广

– MycoAlert™PLUS和MycoAlert™支原体检测测定

– ATP分析，例如 ViaLight™细胞增殖和细胞毒性测定

–腺苷酸激酶测定，例如 ToxiLight™非破坏性细胞毒性测定

–萤光素酶报告基因分析

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由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时，能及时处理并除去污染物，部分细胞还有可能得到挽救。

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

 

支原体污染

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可做如下检测：
a:相差显微境检测；b:荧光染色法；c:电镜检查；d:DNA分子条文检查或支原体培养等方法。处理：市场上有多种支原体清除试剂盒，效果比较好。

 

支原体的检测方法

支原体的污染需要特殊的检查方法，常用的有 DNA 荧光染色法、支原体培养、ELISA、电镜和聚合酶链式反应（PCR）等，由于支原体种类众多，检测有失败的风险，通常推荐采用两种以上的检测方法。

2015版中国药典规定：“主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检査支原体，必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。”

（1）DNA染色法：用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A，感染支原体的Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核，其周围蓝色荧光小点为支原体(箭头)；B，未感染支原体的阴性对照Vero细胞；C，加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。

（2）低涨处理地衣红染色观察法：用2 %醋酸地依红染色固定后，封片，镜下观察支原体呈暗紫色小体，附于细胞外或散在于细胞之间。

（3）培养法：将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

（4）ELISA：有专为支原体检测开发的酶联免疫分析试剂盒，通过样品显色反应与标准品对比得出结果。

（5）电镜：一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

支原体电镜扫描图片

（6）PCR：PCR检测法灵敏度高，特异性强，只用一天时间即可快速检测细胞培养液中的支原体，是一种检测支原体的有效手段。引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定，目前也有专门的试剂盒，如PCR Mycoplasma Test Kit（Applichem）。

PCR法支原体检测电泳图。+：阳性对照；-：阴性对照；1：送检样品1（感染支原体）；2：送检样品2（未感染支原体）；3：样品1的干扰实验；4：样品2的干扰实验。若在270bp处有条带，检测结果为阳性。阳性对照及干扰实验PCR产物在270bp处有一条带，阴性对照无条带，证明本次实验准确可靠。

 

支原体的介绍

支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。